细胞毒作用的测定

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细胞毒作用的测定

细胞毒作用的测定

第一节补体依赖的细胞介导的细胞毒作用
基本原理
本实验利用有补体存在的条件下特异性抗体溶解靶细胞的方法检测和鉴定特异性抗体。同样，在已知的特异性抗体和补体存在的条件下本法也可检测细胞的特异性抗原。此项技术适用于人类白细胞Ⅰ类抗原的鉴定，或是利用抗血清或单克隆抗体与细胞表面所表达的特异性抗原反应来进行细胞亚群的分离。其原理是抗原抗体复合物激发补体经典途径，抗原细胞膜的被破坏。由于这些细胞的膜通透性发生了改变，染料（例如：台盼蓝染液）可通过膜进入细胞内部，故可用于指示死细胞或濒死细胞
  
试剂与器材
·抗血清或单克隆抗体，肝素抗凝血（外周血单个核细胞来源）
·Hank，s平衡盐溶液（商品）
·4g/l台盼蓝染液（溶解在PBS液中储备）
·石蜡油
·盐溶液（用蒸馏水配制9g/l的NaCl溶液）
·37%甲醛
·滤纸
·兔补体（兔婴血清）
·微量移液管/微量玻璃加样器（刻度精确到1μl）
·1ml圆底聚丙烯管（用于抗血清/单克隆抗体和补体的稀释）
·微量滴定盘（Terasaki盘）
·倒置显微镜（配有相差装置，10倍和40倍放大镜）

操作步骤
此技术用来鉴定细胞类型。若使用5ml圆底聚丙烯管和相应增加细胞数目、试剂体积，此技术也可用来筛选细胞。
  一. 抗体在微量滴定盘中的分布
  1. 在微量滴定盘中滴入1μl的石蜡油，用以防止盘中液体蒸发。
2.      在微量滴定盘中滴入1μl处理过的已知特异性抗血清或单克隆抗体，需要时,用Hank，s液做适当稀释。用同种非免疫血清封闭板孔，以非相关单克隆抗体和Hank，s液作阴性对照。在每次往盘中滴加另一种试剂前都要用微量玻璃加样器装上蒸馏水仔细冲洗微量滴定盘。
3.      如果用已知抗血清或单克隆抗体来鉴定未知细胞，应尽可能使用抗原阳性细胞作为阳性对照，方法同上。
        4. 记录标本在微量滴定盘盘中的分布。
      二. 外周血单个核细胞的分离
        1. 参见第一篇第一章第一节，用Hank，s液将细胞浓度调至2×106/ml。
      三. 细胞在微量滴定盘中的分布
        1. 使用微量玻璃加样器在微量滴定盘每孔中滴加1μl外周血单个核细胞（2×106/ml）。
        2. 用蒸馏水仔细冲洗微量滴定盘。若需要，在吸水纸上将微量滴定盘拍干。
        3. 室温孵育30分钟。
      四. 滴加补体
        1. 加入3μl 经过欲试已确定为最佳稀释度（1:2～1:64）的兔补体，37℃孵育60分钟。
        2. 轻轻震摇微量滴定盘。
      五. 细胞毒性检测
        1. 在每孔中加入3μl台盼蓝（储备液），室温孵育10分钟。
        2. 加入3μl 37%甲醛溶液（低渗）。
3. 使用倒置显微镜观察计数。

结果分析
1.      在每孔中计数蓝染细胞百分率（既濒死或死亡细胞数）。
2.      计数特异性细胞毒性百分率（即实验孔死亡细胞百分率—阴性对照孔死亡细胞百分率）。当结果≥20%时，反应为阳性，记录结果。
3. 分析阳性反应类型以确定实验抗体的特异性或是鉴定一个特定的抗原（例如：人白细胞Ⅰ类抗原单倍型）。

质控
1.      阴性对照：来自同种标本的非免疫血清或非相关单克隆抗体（例如：AB血型的人血清中无抗HLA-Ⅰ类抗原的抗体）。
2.      外周血单个核细胞阴性对照应含少于10%的死亡细胞。
3. 阳性对照：超免疫人或动物的血清或是已知的阳性单克隆抗体。

实验要点
1.      选择缺乏自发细胞毒作用和对于抗外周血单个核细胞的抗体（商品）有高度特异性活性的兔婴混合血清作为补体的来源，此血清分装冻存于﹣80℃。由于补体分子非常不稳定，故不可反复冻融补体血清。
2. 所使用的单克隆抗体应是补体（C1q）能与此抗体的同型连接，且能使补体活化。
3. 过多的破碎细胞会造成假阳性反应（例如：白血病细胞、溶解细胞、支原体污染的培养细胞）。
4. 细胞滴加到盘中后长时间放置不检测也可导致假阳性反应。
5. 抗原表达弱亦可导致假阴性反应。

临床应用
1. 人白细胞抗原类型测定（参见     ）。
2.      使用一系列外周血单个核细胞进行抗体筛选检查（例如：检测HLA抗体）。
3.      检测器官移植受体的免疫性（交叉-配对）。
4.      检测自身抗体特性（自身免疫反应，输液）。