【转贴】通心络对脑缺血再灌流后黏附分子表达及脑水肿的影响

济**馨

摘 要

     目的 观察通心络对大鼠脑缺血再灌流后黏附分子表达及脑水肿的影响。

     方法 通过线栓法制作大鼠大脑中动脉缺血模型(MCAO),并于缺血2小时后再灌流。再灌流22小时后取脑,用RT-PCR方法检测细胞间黏附分子(ICAM-1)和E-选择素(E-selectin) mRNA在缺血脑组织中的表达。再灌流后即刻经胃管灌入通心络,并检测其对ICAM-1和E-selectin mRNA表达的影响。用干湿重法计算脑水含量。

     结果 再灌流后22小时,缺血脑组织中ICAM-1和E-selectin mRNA表达增加,脑水含量增加;通心络能抑制ICAM-1 mRNA的表达,减少脑水含量,对E-selectin mRNA表达无明显影响。

     结论 在大鼠缺血再灌流后即刻给予通心络,能够减轻其脑水肿,起到脑保护作用,这种作用与抑制ICAM-1 mRNA的表达有关。

   

     脑血管病是严重危害人类健康的一组疾病,致死率和致残率都很高,给社会造成巨大的负担。近年来的研究表明,脑缺血再灌流后炎症反应是继发性脑损伤的重要原因之一。缺血后早期,黏附分子在内皮细胞表达增加,并对白细胞的黏附和转移起重要作用。

     本研究通过观察通心络对大鼠大脑中动脉缺血再灌流后内皮黏附分子表达及脑水肿的影响,进一步阐明通心络在再灌流后脑损伤中可能的作用机制,为缺血再灌流后继发性脑损伤的治疗提供新的思路。

     材料与方法

     1. 主要仪器与试剂

     PCR仪:PTC-200(美国MJ公司)。凝胶成像分析系统: Gene Genius Gel Documentation and Analysis System。Heraeus高速低温离心机、SHIMADZU(岛津)UV-240紫外分光光度计、TRIzol Reagent 为Gibco BRL产品。AMV逆转录酶为Promega产品。Taq酶、dNTPs、Rnasin、Olig(dT)15、DEPC、琼脂糖购自北京鼎国公司。委托上海博亚有限公司进行引物合成,其中引物序列ICAM-1:上游为5’-ACAGACACTAGAGGAGTGAGCAGG-3,下游为5’-GTGAGCGTCCATATTTAGGCATGG-3’,扩增片段长度为329bp;E-selectin:上游为 5’-GGCGCCAGGTGAACCAAACAAC-3’,下游为 5’-CCATGCTGCTGGGCACATAGCC-3’,扩增片段长度为368bp;β-肌动蛋白(ACTIN)序列:上游为 5’-ATGGATGACGATATCGCTGCGCTC-3’,下游为5’-AGGTCCAGACGCAGGATGGCATGA-3’,扩增片段长度为539bp。通心络粉末由河北以岭医药集团提供。

     2. 实验动物

     体重为250~320g的雄性Wistar大鼠24只,由天津卫生监督所实验动物中心提供。将大鼠随机分为通心络组、模型组和对照组,每组8只。

     3. 大脑中动脉缺血再灌流模型制作

     参照Zea Longa 腔内线栓法制作大脑中动脉梗塞模型。术后两小时观察大鼠症状,根据Zea Longa 5分制评分标准,1~2分为模型成功。缺血2小时后,**麻醉抽出尼龙线,恢复大脑中动脉血供,实现再灌流。通心络组于术后2小时拔除线栓后即刻胃管注入通心络1.0g/kg;模型组以等体积生理盐水代替通心络;对照组尼龙线只插到颅底,没有阻塞大脑中动脉。Zea Longa 5分制评分标准:0分:无神经损害症状,活动正常;1分:不能完全伸展病灶对侧前肢;2分:行走时身体向病灶对侧转圈;3分:身体向病灶对侧倾倒;4分:不能自发行走,意识丧失。

     4. 标本收集

     术后24小时用水合氯醛过量麻醉后将大鼠断头处死,在冰皿上迅速取出脑组织,于其右半球自嗅结节前缘起,做冠状切片,其厚度依次为1.5mm,3mm,4mm。将3mm切片用液氮冷冻3分钟后置于-70℃冰箱,备用于总RNA的提取,4mm的脑组织用于脑水含量的测定。

     5. 总RNA提取和RT-PCR

     总RNA的提取 采用Trizol试剂,按照说明步骤操作。RNA样品的A260/A280比值在1.7~2.0之间。

     RT-PCR逆转录反应体系组成 5×PCR buffer 5μl,Olig(dT)15 1μl,10 dNTPs(10mM) 2μl, Rnasin(40U/μl) 0.5μl,总RNA 5μl,AMV逆转录酶(5U/μl) 3μl,DEPC水 8.5μl 总体系 25μl 。

     逆转录反应条件 42℃90分钟→95℃ 5分钟→放置冰上5分钟→-80℃保存。

     PRC扩增目标cDNA PCR反应体系组成:10×PCR 缓冲液 2μl dNTPs(10mM) 1μl,上行引物(20pM) 1μl,下行引物(20pM) 1μl,TaqDNA 聚合酶(2U/μl) 1μl,cDNA 4μl,双蒸水10μl ,总体系 20μl。PCR反应条件:预变性 95℃ 5min;变性95℃ 1min,退火E- selectin、ICAM-1分别为56℃和60℃,延伸72℃90sec,共30循环;终延伸72℃ 10 min。

     PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析 将8μl PCR产物加样于2%琼脂糖凝胶中,以60V电泳1h,在紫外灯下观察结果并拍照;在凝胶呈像分析系统中分析每一样品待测基因PCR产物条带的灰度值及相应β-肌动蛋白 PCR 产物条带的灰度值,以两者的比值反应原始样品中待测基因 mRNA的表达水平。

     脑水含量的测定 术后24小时取脑,用干(110℃ 24h烘干)、湿重法计算脑水含量,作为脑水肿程度的判断。计算方法:脑水含量(%)=(湿重-干重)/湿重×100%。

     6. 统计学处理

     所有数据均以均数±标准差(x±s)表示,应用SPSS统计软件进行单因素方差分析及q检验,P<0.05为显著差异。

     结 果

     1. 通心络对脑水含量的影响

     模型组与对照组比较,脑水含量明显增加10.1%(P<0.05),通心络治疗组与模型组比较,脑水含量减少5%(P<0.05)(表1)。

     2. 通心络对ICAM-1mRNA表达的影响

     缺血再灌流后22小时,缺血侧ICAM-1 mRNA 表达增加(P<0.05),通心络治疗后ICAM-1 mRNA表达下降(P<0.05)。再灌流后22小时E-selectin mRNA表达增加(P<0.05),通心络治疗后无明显变化(P>0.05)(图、表2)。

     讨 论

     再灌流早期大量中性粒细胞穿过血脑屏障进入脑组织,这是再灌流后炎症反应的核心表现。白细胞浸润可以通过多种机制加剧脑损伤,其可阻塞微血管,形成无复流现象;可浸润到脑组织中,释放溶酶体酶,使组织蛋白水解破坏,加重脑水肿;也可能直接损伤血管内皮,引起血管源性脑水肿和脑出血。脑水肿是脑梗塞患者早期死亡和影响预后的主要因素,因此早期阻断炎症反应,减轻脑水肿在临床上至关重要。

     白细胞进入损伤组织是由炎症介质激活内皮细胞开始的,激活的内皮迅速分泌P-选择素,诱导E-选择素和ICAM-1等细胞黏附分子的表达。在大部分血管床,选择素能介导白细胞与血管内皮的初始接触和沿着血管壁的滚动,白细胞整合素与内皮细胞表达的细胞间黏附分子相互作用,介导了白细胞与内皮的紧密粘附和进一步游出。在激活的内皮表达的ICAM-1和E-selectin,是引起白细胞粘附和渗出的主要黏附分子。

     许多研究证实,脑缺血再灌流后早期ICAM-1和E-selectin在微血管内皮细胞表达增加,对再灌流后炎症反应起重要作用。单克隆抗ICAM-1和E-selectin抗体对大鼠的短暂性脑缺血提供保护,这在对灵长类动物的实验中也取得了理想的效果。ICAM-1基因去除小鼠脑缺血损害明显减轻。ICAM-1和E-selectin的增加也在卒中后的人脑和血浆中被检测到。但用黏附分子抗体治疗人类卒中的研究并未达预期效果,反而使临床症状加重,死亡率增加。这提示单独的黏附分子抗体对缺血后炎症的治疗具有很大的局限性,并不能在不产生明显副作用的情况下,发挥持久的作用而改善远期预后。因此从其他途径抑制黏附分子的表达,从而抑制再灌流后炎症反应成为目前研究的热点问题。最近的研究也发现,一些抗炎药物,蛋白酶抑制剂、高压氧、亚低温治疗等能减轻缺血后,尤其是再灌流后中性粒细胞的浸润和黏附分子的表达,减轻缺血性脑损伤,但这些药物及治疗的临床应用仍需进一步研究。

     通心络是运用中医络病理论研制而成的中药复方制剂,由人参、水蛭、全蝎、土鳖虫、蜈蚣、蝉蜕、赤芍、冰片等组成,具有益气活血、通络止痛之功效。许多临床研究发现,通心络具有抗凝和抑制血小板聚集,降低血脂和血黏度,显著改善血管内皮功能等作用,对冠心病心绞痛具有明显的疗效。吴宗贵等的研究提示了通心络能降低血管内皮生长因子在家兔主动脉粥样斑块中的表达,从而发挥稳定斑块,降低血清ox-LDL含量,抑制粥样斑块发展,保护血管内皮功能的作用。临床研究也发现,对于急性脑梗塞患者,通心络能改善其临床症状,促进其功能恢复。

     本研究提示,缺血再灌流后脑组织中内皮黏附分子ICAM-1、E-selectin mRNA的表达增加,伴随脑水肿加重;通心络能减轻再灌流后脑水肿,发挥脑保护作用。这种保护作用与抑制ICAM-1 mRNA的表达有关,而对E-selectin无明显抑制作用。