【转贴】正确应用结合胆红素和△胆红素

小****1

近期来，国内的医学书籍和期刊开始仿照国外的做法，将原来的直接胆红素改成了结合胆红素，间接胆红素改为游离胆红素。若不全面了解相互的差别，国内在检验上存在的差距，对于临床应用是一个严重错误。为澄清问题，以下对胆红素的有关内容作简要回顾。
一．  胆红素的来源和代谢途径
1．胆红素是红细胞代谢产物。生存了120天的衰老红细胞在网状内皮系统，特别是脾脏处
被巨噬细胞吞噬后破坏。血红蛋白的蛋白部分-珠蛋白被分解吸收进入蛋白库，重新利用；
铁被转铁蛋白结合；起氧化还原作用的血色素被血色素氧化酶氧化破坏，打开血色素环，成为胆绿素，由经胆绿素还原酶作用成为胆红素。1g降解的血红蛋白产生34mg胆红素，平均每天由血的降解产生的胆红素为250mg。这些胆红素约为所有胆红素的80~85%。其余15~20%的胆红素来自含有血色素的蛋白，如肌红蛋白、细胞色素、过氧化氢酶、以及在骨髓中红细胞成熟的生理变异（无效的红细胞生成作用）产生的降解产物。
2．来自破坏红细胞的胆红素也称为游离胆红素（Bu）。游离胆红素有强烈的极性、几乎不溶于水。因为胆红素被自身的6对氢键作用，使分子折叠为Z-Z型（双Z型），将所有亲水的基团包围在内侧，表现为不溶于水。
溶血性黄疸的新生儿，可以采用紫外光的照射治疗方法。其实，就是由紫外光破坏游离胆红素的氢键，胆红素分子形成部分打开的异构体（Z-E型或EZ型）、或完全打开的异构体（E-E型）。这些异构体分子上亲水键的释放，使胆红素可以溶于水，容易被排出体外。
3．在血液中，游离胆红素和白蛋白结合。藉此，将血色素破坏产生的胆红素运送至肝脏处
理。游离胆红素不溶于水，可以溶解于脂肪或有机溶剂。在碱性pH条件下，溶解于水的溶解度会增加。
4．胆红素在肝窦中与白蛋白分离，透过细胞膜，在细胞浆内与结合蛋白Y和Z结合，在滑
面内质网中使胆红素内侧的2个丙酸基与葡萄糖醛酸结合，形成了胆红素的葡萄糖醛酸酯。只有一个丙酸基形成葡萄糖醛酸酯的为胆红素单葡萄糖醛酸酯；2个丙酸基都形成醛酸酯的为胆红素双葡萄糖醛酸酯。整个胆红素醛酸酯的形成均有酶参与。这些和葡萄糖醛酸结合的胆红素称为结合胆红素（Bc）。因为使胆红素具有了水溶性，就可以将胆红素排出体外。但是，需要注意的是，“结合胆红素”并不单单是葡萄糖醛酸酯的胆红素，还有和其他酸形成的结合胆红素，如胆红素的硫酸酯。
5．Bc从肝细胞运输至毛细胆管，经胆管以胆汁的形式流入肠道，然后和粪便一起排出体外。
可是，结合胆红素进入毛细胆管是需要有能量依赖的，也是胆红素代谢中最慢的一步。
健康的肝脏每天分泌Bc 1g，是生理胆红素聚集的2-5倍。
6．结合胆红素通过胆管到达小肠，在肠内细菌的作用下生成尿胆原，约70%的尿胆原在小肠被重吸收，通过门静脉返回肝脏，再通过胆管分泌（肠肝循环）。每天从尿中排泄的尿胆原是2-4mg, 在胆红素堆积如溶血性贫血时，增高2-3倍，在肝实质损伤如急性病毒性肝炎或门静脉分流术时，增高4-10倍。胆管阻塞导致尿胆原肠肝循环受阻，在胆红素尿中尿胆原检查为阴性。余下的尿胆原在大肠内由细菌的作用进一步被氧化处理，成为粪胆原和粪胆素。这些色素和粪便一起排出体外。
Bc是水溶性的，可被肾小球滤过，在正常生理情况下，通常在血浆中不能检测到。急性
病毒性肝炎时高胆红素血症，是由于肝实质损伤导致Bc越出了毛细胆管至血液，尿液中亦可出现胆红素。
7．还有部分游离胆红素和白蛋白共价结合，这样的胆红素为△胆红素（Bδ）。△胆红素的
半衰期约18天，在健康成人、Gilbert综合征以及新生儿高胆红素血症中检测不到；高结合胆红素血症时Bδ与总胆红素的比例异常，如实质性黄疸或阻塞性黄疸，在急性期可占到20-50%，当临床恢复期总胆红素下降时，Bδ的比例可上升至50-90%。
高结合胆红素血症，尤其是阻塞性黄疸时，Bc的快速下降（Bc的半衰期仅几个小时）是阻塞完全消退的最敏感指标。用总胆红素检测来评价高结合型胆红素血症并不合适，因为在检测中包含了半衰期为18天的Bδ，然而，若有只检测Bc的方法则可评价高结合型胆红素血症。
二．依据偶氮反应的特点，将胆红素区分为直接胆红素、总胆红素
1．在参与偶氮反应时，和偶氮试剂直接起反应的胆红素称为直接胆红素。应该讲，只有能
溶于水的胆红素才会直接和偶氮试剂反应形成偶氮胆红素。所以，结合胆红素参与了直接反应。但是，任何反应需要时间。国内长期来，误解了：结合胆红素参与反应非常快，整个反应只要1分钟。其实，结合胆红素参与反应的影响因素很多。例如：反应时使用的偶氮试剂的浓度、pH、反应时间等。结合胆红素的偶氮反应的初期确实很快，但是，要使所有结合胆红素完全参与反应，需要30分钟以上。因此，目前任何一个在自动分析仪上的直接胆红素测定都是不完全的（反应时间太短）。
另一个方面，血清中的少量游离胆红素也会参与直接反应。因为血清中有尿素、尿酸等，早期的研究已经肯定，这些物质的存在，具有促使游离胆红素打开氢键、参与直接反应的可能。按照胆红素的代谢途径，在健康人的血清中，只有由白蛋白携带的游离胆红素；被肝脏处理过的结合胆红素经胆管进入肠道，不会进入血液。所以健康人的血清内不应该有直接反应的胆红素。可是，健康人的直接胆红素不是0。所以：反应完全的直接胆红素为结合胆红素和少部分的游离胆红素的和。目前国内外报告的直接胆红素结果，只是结合胆红素一部分，又含有了一些游离胆红素；而且，不同的检测系统或方法间的可比性很差。世界上室间质量评估最有权威的美国临床病理学会（CAP）调查结果中，问题最大的仍然是直接胆红素。
2．在破坏氢键的试剂存在下，如：甲醇、乙醇、尿素、苯甲酸钠、**、乙酸钠、表面活性剂等，破坏了游离胆红素的氢键，使胆红素分子的亲水基团参与偶氮反应。这样，检测的是游离和结合胆红素二者。称为总胆红素。
3．D胆红素：在高胆红素血症时，病人血液内较长的时间内胆红素浓度很高。此时，血液中的白蛋白“浸泡”在胆红素环境中，促使部分白蛋白和胆红素共价结合，也是一种结合胆红素，称为D胆红素（delta-胆红素）。它不同与正常条件下，游离胆红素藉血液中白蛋白运输至肝脏时，此时的胆红素和白蛋白的结合是松散的，这些结合物不是D胆红素。所以在健康人的血清中检测不出△胆红素。若能检测出D胆红素，一定和有较长时间的高胆红素血症有关；或者说明前期血液胆红素浓度较高，因为△胆红素的半衰期约18天，即使目前血液胆红素已经正常，但是D胆红素的检出反映了以往的情况。现在，可以使用层析方法分离出大分子量的胆红素组分，然后再检测胆红素量。Johnson-Johnson的Vitros干片分析仪可以直接检测出D胆红素。
4．综上所述，血液中的胆红素从结构上分为：游离胆红素、结合胆红素、和D胆红素。
用检测的方法得到的胆红素结果有：总胆红素、直接胆红素和D胆红素。其中：直接胆红素量应该包括D胆红素；但是，总胆红素量减直接胆红素量不等于游离胆红素量。
5．国外近期对胆红素的检测，改为结合胆红素和游离胆红素，逐渐不用直接和游离的提法。
这是在这20余年中，国际医学界对美籍华人吴黛云（译音）等研究的肯定。
（1）他们建立了胆红素测定的HPLC方法，通过层析，可以将人血清内的胆红素分离
出和定量游离胆红素、双葡萄糖醛酸酯胆红素、单葡萄糖醛酸酯胆红素和D胆红素。
（2）应用HPLC技术，获得人的双葡萄糖醛酸酯胆红素、单葡萄糖醛酸酯胆红素纯品，是以后研究检测这2个胆红素的基础。
（3）对Doumas等提出的直接胆红素的偶氮方法（反应10 min），采用人的双葡萄糖醛酸酯胆红素、单葡萄糖醛酸酯胆红素纯品进行了详细而严格的评价。认为该方法基本上可以反应血清中的结合胆红素量，但是还有差距（平均约为实际结合胆红素量的80％左右）。
（4）针对临床的需求，开发了完整的分光光度技术。可以正确报告结合胆红素和游离胆红素。另外，也对D胆红素建立了检测方法。这样，完成了血清中3个主要结构的胆红素都可以准确检测。这些研究是在当时的Kodak的EastChem公司主持下完成的，以后也就成为该公司的干片检测项目的强项。形成了现在的Vitros。
（5）多年来，从大量文献和报告中，临床肯定了使用吴黛云干片技术检测3类胆红素的结果的可靠性。今年的美国临床化学杂志第一期，针对CAP调查中为什么反应Vitros的总胆红素结果离散大的原因，Doumas等人进行了研究。发现CAP调查的样品采用牛血清、加游离胆红素和双牛磺酸胆红素制备而成，这些人造的样品不是Vitros能做好的。因为Vitros只能对人的新鲜血清可以提供可靠结果。
在多年对Vitros信任的前提下，临床书籍和刊物开始将胆红素检测的项目改成结合胆红素、游离胆红素、总胆红素和D胆红素。
三．胆红素测定的标准化
1．确认总胆红素的测定使用Doumas推荐的改良J-G法和游离胆红素为标准，这是1975年才确定的。至今，国际上公认美国的标准品SRM-916是临床检验的第一标准。但是，还没有总胆红素或直接胆红素的参考方法。只有Doumas提出的改良J-G法（**法）为推荐法。（2004年的Clin.Chem上，将该法称为参考方法）
以往，只是对怎样的胆红素是纯的提出了使用胆红素***溶液的分光比色方法。究竟在
实际对病人标本测定时，如何解决总胆红素结果可靠性问题，还是Doumas推荐：采用
偶氮化后的比色吸光度值，可以达到校准的效果。因此，在Doumas的推荐方法中，还
确定了如何配制含有血清的胆红素标准。多年来，被认可的胆红素标准只有这样的标准。
2．关于直接胆红素的标准
1985年，Doumas 就想解决直接胆红素的标准。他提出使用双牛黄酸胆红素
（Ditaurobilirubin，DTB）。DTB的水溶性很好，将它配制在人血清或人血清白蛋白中，
进行了实验观察。当时，认为DTB参与直接胆红素反应的表现，和人血清内结合胆红素相似。但是，反应较人血清的要快。以后，一直至今，Doumas再也没有其他的报告。可以认为，Doumas对DTB不满意。DTB不能成为直接胆红素的标准。
在1995年的前后，出现了使用过氧化物直接氧化胆红素测定的方法。这类方法若单单测定总胆红素，可以使用Doumas推荐的游离胆红素的标准。可是，这些方法不仅测定总胆红素，又可测定直接胆红素，就不能使用游离胆红素为标准。产品的厂商都采用了DTB为标准，既作为直接胆红素标准，又是总胆红素的标准。
这类氧化方法简单、快速，适宜在自动分析仪上使用。可是，所有方法在说明结果的可靠性上，都讲：它们的直接（或被称为结合）胆红素结果和Doumas的直接胆红素具有可比性。问题是：这些公司连什么是正规的直接胆红素测定方法都不懂，根本无法说明直接胆红素结果的可靠性。从标准化的溯源性上已经没有了依据。
五．几点观点
1．所有在自动分析仪上的偶氮方法，测定总胆红素是可以的。但是，限于分析仪对检测时
间的限制，没有一个仪器的反应时间能满足直接反应的要求（30分钟）。所以，直接胆红素检测的质量问题是国际性的。至今没有解决。但是，一个项目应该有一个检测方法，这个方法的结果是大家认可的。直接胆红素的项目恰好是最典型的例子：公认Doumas介绍的直接胆红素测定方法结果，是最好的。一般来说，这种公认的方法，都是手工操作的。（注意：所有公认的参考方法都是手工方法，没有一个自动分析仪的方法是参考方法！）这个方法就是手工方法，你的结果准不准，还得和它作比较。
2．结合胆红素和直接胆红素
临床上的需要实际是对结合胆红素的需求，因为它可以真正反应肝胆疾病的情况。以往
的检测方法的局限性，只能是直接胆红素，它的相当部分是结合胆红素，又有一些游离胆红素。但是，一定不等于结合胆红素。而且，不同方法的反应条件不同，二者的差距也不同。从现有资料上，一般的方法和结合胆红素差距都很大。在美国临床病理学会（CAP）的全球室间质量调查中，历年来，直接胆红素结果是最差的。只有强调在同检测系统的比较下，完全相同的检测系统内的CV可以较小，但是在各系统间的检测均值差异很大。
3．目前，只有Johnson-Johnson公司的Vitros仪器上，可以检测结合胆红素。在20年前，
公司的研究人员用层析方法获得了纯的单和双葡萄糖醛酸胆红素，并对这些结合胆红素参与公司干片反应进行了详尽的研究，最后得到了病人血清结合胆红素测定结果，用高效液相层析方法进行对比，说明可靠。至今是被认为：这是真正的结合胆红素的结果。国外已经很普遍使用该公司产品，直接报告为结合胆红素。国内使用该公司产品不多，所以了解的人很少。
4．新生儿溶血的血液中，含有大量肝脏处理不了的游离胆红素。所以，只要做总胆红素的
测定，就可反应大致情况。能直接做游离胆红素最好。但是使用目前的一般偶氮方法的
检测，胆红素的可报告范围没有被确认，在检测系统较差的情况下，会低估新生儿的黄
疸，容易使临床产生误解，对患儿处理不当，产生严重后果。
5．现有的偶氮方法报告的直接胆红素，在反应肝功能上不完整。临床常将直接胆红素误理
解为结合胆红素，又将它和总胆红素的差视为游离胆红素。这些，都对临床治疗有影响。
另外，严重胆道堵塞患者血液胆红素长期增高，形成了很多的D胆红素。如果不检测D胆红素，单单报告直接胆红素，结果不可靠。尤其在外科手术解除了胆道问题后，因D胆红素半衰期长，使直接胆红素仍然偏高，容易使临床对手术是否成功产生怀疑。

乐*

有兴趣的朋友可以看看这篇文章。

Conjugated Bilirubin: A Better Indicator of Impaired （英文全文和我的翻译）
https://bbs.iiyi.com/forum.php?m ... =26908&fpage=10