HLA基因分型方法研究进展

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人类白细胞抗原（liuman Leukocyte Antigen，HLA）是位于人类第6号染色体短臂上一组紧密连锁的基因群，是目前人体中最具有多态性的遗传系统，由三类基因组成，即Ⅰ类基因、Ⅱ类基因和Ⅲ类基因，可以作为一个遗**位或单倍型（haplotype）而遗传给下一代，属共显性等位基因［1］。人类白细胞抗原（HLA） 系统是机体免疫系统的重要组成部分，在机体的抗原呈递和免疫应答中发挥重要作用。HLA基因与人类多种疾病的发生、发展和预后密切相关。
    人类的I类基因位点命名为HLA－A、HLA－B、HLA-C，分布于所有的组织细胞上，为细胞膜上的移植抗原，是引起移植后排斥反应发生的主要抗原。Ⅱ类基因则命名为HLA－D，HLA－D又分为HLA-DR、HLA-DQ、HLA-DP等亚区，主要分布于免疫细胞上，它们可以作为免疫细胞间识别标记而诱发免疫应答和调节免疫细胞间的相互作用，在免疫应答反应中发挥重要作用。Ⅲ类基因区位于HLA-I、Ⅱ类基因区之间，由一些与补体和某些炎症因子编码相关的基因组成。这些基因在机体的免疫及机体对外界环境的适应性方面均有重要作用。准确的HLA抗原分型技术无疑在基础研究和临床应用上都有很重要的意义,本文就近年来HLA基因分型研究进展加以综述。
    Terasaki等（1964年）最早创造了简便易行、敏感可靠、重复性好的微量淋巴细胞毒试验，为HLA的血清学研究开启了大门。随后随着分子生物学技术的不断发展，HLA分型方法分别经历血清学分型、细胞学分型和DNA分型三个阶段。
　　1  血清学分型法
    经典的HLA血清学分型方法是使用微量淋巴细胞毒试验。但由于HLA等位基因序列的高度同源性，使血清学出现较多较强的交叉反应，获得特异性高的抗体受到限制，影响了分型结果的正确性。Mytilineos等［2］用DNA-RFLP和血清学方法对  HLA－DR分型进行比较，结果表明血清学方法HLA-DR分型错误率竟在25%以上，相比而言，对于HLA-I类抗原，血清学分型结果可信度更大。但与DNA分型相比，即使用于HLA-I类抗原，血清学分型仍然会出现错判或漏检，这是因为缺乏对抗原反应的特异性抗血清或目的抗原被同一交叉反应组内另一抗原掩盖，尤其是用于B位点的检测。1991年，第11届国际组织相容性专题研讨会对HLA血清学研究进行了总结，HLA血清学研究大体告一段落。
　　 2  细胞学分型法
    可用于测定HLA-Dw和HLA-DPw抗原的特异性。由于分型所需的细胞来源困难及细胞表面抗原的复杂性，且方法繁琐，因此细胞学方法不再作为常规分型，已逐渐被淘汰。此外，用细胞学方法所检出的特异性均加上“w”，以此与补体成分相区别。
　　 3  分子生物学分型法
    80年代后期，随着PCR技术的不断进步，分子生物学分型方法被人们应用于HLA研究领域，最常见的方法有：SSP,SS0,SBT等。
    3.1  多聚酶链反应-限制性片段长度多态性（polymerase chainreaction-restriction fragmentlength polymorphism，PCR-RFLP）［3］  RFLP分析是最早建立的研究HLA多态性的DNA分型技术。不同等位基因由于其核苷酸序列不同，所以就有不同的酶切位点和数目。酶切后产生不同长度、不同数目的DNA片段，经电泳、染色、紫外照射成像后即可确定HLA基因型别。若DNA片段先扩增，再酶切即为结合PCR技术的PCR-RFLP，提高了敏感度与准确性。Maeda等［4］最早应用以PCR为基础的PCR-RFLP技术对HLA-Ⅰ类和Ⅱ类分子进行了成功检测。但该类方法大多存在着操作复杂、容易产生差错等弊病。
    3.2  多聚酶链反应-序列特异性引物（polymerase chain reaction-sequence specific primer，PCR-SSP）［5］  根据HLA核苷酸碱基序列的多态性和已知的DNA序列，设计一系列等位基因型别特异性序列引物，通过特定的PCR反应体系扩增各等位基因的型别特异性DNA片段，产生相对应的特异性扩增产物条带，然后通过凝胶电泳检测PCR产物。根据是否得到PCR产物以及产物的片段大小来分型。其特点是操作简单，对实验设备要求不高，扩增后处理过程十分简单。但是PCR-SSP技术也存在着不足，该方法需要设计大量的引物，对引物的设计和PCR条件要求很严，且容易造成污染，产生假阳性，而且对样本DNA的用量也较大，给临床应用带来了不便。
    3.3  多聚酶链反应-序列特异性寡核苷酸反应（polymerase chain reac-tion-sequence specific oligonucleotide probingPCRSSO或PCR-SSOP）  对HLA的多态区域进行扩增，在扩增过程中对PCR产物进行同位素或非同位素标记，然后针对PCR扩增产物根据碱基配对原则设计系列寡核苷酸探针固定在膜上，最后将PCR产物与膜上的探针杂交、放射自显影，根据信号判断结果为PCR-SSOP技术的基础。PCR-SSOP技术用于HLA分型主要包括正相SSOP方法和反相SSOP方法两种,前者是将PCR产物固定在膜上，用标记的探针与之进行杂交，后者是将特异性探针固定在膜上。用标记的PCR产物与之杂交。目前广泛采用的是反相SSOP方法。Yasunaga 等［6］和Dyer等［7］对成功应用PCR-SSOP技术对HLA进行分型,并且广泛应用。PCR-SSOP技术具有灵敏度高、特异性强、需样本量少的特点。但是由于所用的载体大多为膜或微滴定板，对于复杂而众多的HLA等位基因来说，它不具有集成化的优点，而且洗脱条件比较繁琐，难以标准化和自动化。
    2000年美国ONE LAMBDA公司［8］和LIFECODES公司开发出的HLA基因分型技术［9］，也称为序列微珠综合分析实验系统，它利用传统PCR-SSOP的原理，样品首先进行非特异性扩增。扩增产物经解链后与包被了特异性HLA DNA探针的微珠结合，在一种专用流氏细胞仪中检测，这种流氏细胞仪可以分析在微珠表面的SSO探针与DNA样品之间的反映情况。获得HLA分型结果。该系统具有较为明显的优势，HLA-A、B、DR分型实验可以在一个单独的管内完成，数据采集时间迅速，大约15s～1min。省时省力，比较适用于骨髓库和脐血库的HLA配型。这是基于荧光流式细胞仪和免疫标记技术相结合的一项新免疫学技术。它有机地整合了有色微球、激光技术、应用流体学、最新的高速数字信号处理器和计算机运算法则。微球的颜色是通过两种荧光染料染色得到的，调节两种荧光染料的比例可以获得100种不同颜色的微球，每种颜色的微球可以携带一种生物探针，探针通过羧基结合到微球表面，因此1个反应孔内可以完成100种不同的生物学反应。通过鉴定微球的颜色来确定反应类型，而对反应的定量分析是通过靶物质上的报告分子完成的，能够实现应用1个试剂同时检测1份标本中1～100个指标，瞬间出结果，极大地简化了临床检测程序，减少了临床检测成本，同时保持了荧光流式细胞仪所具备的准确、敏感、特异和重复性好以及快速出结果等优点。
3.4  Pyrosequencing技术［10］  2003年该技术被应用于HLA高分辨分型，成为继RSCA策略后第一个真正对基因进行高通量高分辨分型的系统。Pyrosequencing的基本原理是一种合成测序并实时监测的分型技术平台。Pyrosequencing一次能够分析70 bp或更长的DNA序列。但是Pyrosequencing分型技术作为一种不需电泳、不需标记核苷酸和引物、精确、高通量的新技术，在分型中有一定的应用前景［11，12］。
    3.5  PCR-指纹图（finger printing） 又称为杂合双链分析（heteroduplexes **ysis）［13］  是20世纪90年代才发展起来的一种快速的基因分析方法。HLA基因具有高度的同源性，在退火期，各个基因的单链DNA除形成各自完全互补的纯合双链外，某些单链DNA还可以与其异源基因的单链DNA配对形成不完全互补的异质双链，不同个体形成不同的分子构象，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳表现为迁移率的不同。该方法是一种快速简易的方法，尤其适用于不相关的骨髓移植供受者的挑选，可以先混合供受者的基因组DNA，再进行PCR扩增，将混合DNA的PCR指纹与供、受者各自的PCR指纹做比较，如果他们的电泳图谱一致，说明供、受者相匹配，否则不匹配。但是，该方法需要较严格的电泳条件，需同时进行供、受者的电泳，以利于在同等条件下进行比较，该方法只能判定供、受者是否相合，难以确定等位基因的特异性［14，15］。
    3.6  基因芯片（gene chip）［16］  基因芯片是指将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有规律地排列固定于支持物上，然后与待测的标记过的样本基因作特异性杂交，通过激光共聚焦荧光检测系统对芯片扫描，并配以计算机系统检测每个探针上的荧光信号，从而获得大量信息。2001年Guo等［17］针对HLA-B中Exon2和Exon3内已知的所有的多态性设计了137条探针，对100例样本（3例纯合子，97例杂合子）作了高分辨度的水平的HLA-B分型。目前国内外许多实验室与多家公司都在积极致力于HLA基因芯片的开发，虽然存在着仪器设备昂贵，方法有待标准化以及信号检测不完美等欠缺，但这些问题很快会得到解决，一旦这种高效的分型方法用于临床，必然会带来巨大的经济与社会效益。
    3.7  直接测序分型SBT（sequence-based typing）［18］  即直接对HLA基因进行测序，该方法无疑是最可靠也最彻底的基因分型方法。目前只有通过测序才可准确证实新发现的HLA新等位基因［19，20］。而且SBT不但可以对DNA测序亦可对eDNA测序来分析基因的表达。现已有公司专门研制HLA分型软件与自动上样的固相测序试剂盒。但SBT会受测序准确性与杂合子难分型的影响。Dinauer等人曾对HLA-DQA1的第2、第3外显子进行双向循环测序得出非常精确的分型结果Ⅲ1 。SBT是科研工作中最理想HLA分型方法，随着自动核酸测序仪的日益普及，这一分型技术可望被广泛应用。
    综上所述，分子生物学技术的迅猛发展给HLA基因分型的研究注入了新的活力，HLA的检测方法也在日益完善，各种检测方法各有其优势与特点。因此不同方法的联合应用将具有优势互补效应，进而更准确地鉴定等位基因。这些方法的建立与应用将大大加深入类对HLA结构与功能的研究，从而在攻克自身免疫性疾病、肿瘤、器官移植排斥反应等起到无可估量的作用，不同的实验室应该根据各自的条件、要求和目的来选择合适的方法。无疑高通量、高自动化及高集成性的方法将是未来HLA分型方法发展的趋势。

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