【推荐】免疫组化操作规程

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免疫组化操作规程

一、 免疫组化操作规程
（一）、仪器设备
1）18cm不锈钢高压锅或电炉或医用微波炉；2）水浴锅
（二）、试剂
1）PBS缓冲液（pH7.2～7.4）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L，KH2PO4 1.4mmol/L。
2）0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（CB，pH6.0，1000ml）：柠檬酸三钠 3g，柠檬酸 0.4g。
3）0.5mol/L EDTA缓冲液（pH8.0）：700ml水中溶解186.1gEDTA·2H2O，用10 mmol/L NaOH调至pH8.0,加水至1000ml。
4）1mol/L的**缓冲液（pH8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至pH8.0,加水至1000ml。
5）酶消化液： a、0.1%胰蛋白酶液：用0.1%CaCl2(pH7.8) 配制。 b、0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。
6）3%甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。
7）封裱剂：
a、甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9.0～9.5）等量混合；
b、油和**(或PBS)配制。
8）**/PBS pH9.0～9.5，适用于荧光显微镜标本；pH7.0～7.4适合于光学显微镜标本。
（三）、操作流程
1、脱蜡和水化
脱蜡前，应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。
1）组织芯片置于***中浸泡10分钟，更换***后再浸泡10分钟；
2）无水乙醇中浸泡5分钟；
3）95%乙醇中浸泡5分钟；
4）70%乙醇中浸泡5分钟；
2、抗原修复
用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片。
1）抗原热修复
（1）高压热修复 在沸水中加入EDTA（pH8.0）或0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）。盖上不锈钢高压锅的盖子，但不进行锁定。将玻片置于金属染色架上，缓慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡5分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10分钟后，去除热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。
（2）煮沸热修复 电炉或者水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至95℃左右，放入组织芯片加热10~15分钟。
（3）微波热修复 在微波炉里加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔5~10分钟，反复1-2次。适用的抗原有：AR，Bax，Bcl-2，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cadherin，Chromogranin A，Cyclin，ER，Heat shock protein，HPV，Ki-67，MDMZ，p53，p34，p16，p15，P-glycoprotein，PKC，PR，PCNA，ras，Rb，TopoismeraseⅡ等。
2）酶消化方法 常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热至37℃，切片也预热至37℃，消化时间约为5~30分钟；胃蛋白酶消化37℃时间为30分钟。适用于被固定遮避的抗原，其中有：Collagen，Complement，Cytokeratin，C-erB-2，GFAP，LCA，LN等。
3、免疫组织化学染色
SP法
1）脱蜡、水化；
2）PBS洗2～3次各5分钟；
3）3%H2O2（80%甲醇）滴加在TMA上，室温静置10分钟；
4）PBS洗2～3次各5分钟； 5）抗原修复；
6）PBS洗2～3次各5分钟；
7）滴加正常山羊血清封闭液,室温20分钟。甩去多余液体。
8）滴加Ⅰ抗50μl，室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。
9）4℃过夜后需在37℃复温45分钟。
10）PBS洗3次各5分钟；
11）滴加Ⅱ抗40～50μl，室温静置，或37℃1小时；
12）II抗中可加入0.05%的tween-20。
13）PBS洗3次各5分钟；
14）DAB显色5～10分钟，在显微镜下掌握染色程度；
15）PBS或自来水冲洗10分钟；
16）苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化；
17）自来水冲洗10～15分钟；
18）脱水、透明、封片、镜检。
S**法
1)脱蜡、水化。
2)PBS洗两次各5分钟。
3)用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2，室温封闭5～10分钟，蒸馏水洗3次。
4)抗原修复。
5)PBS洗5分钟。
6)滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟。甩去多余液体。
7)滴加Ⅰ抗,室温1小时或者4℃过夜或者37℃1小时（4℃过夜后在37℃复温45分钟）。
8)PBS洗三次每次2分钟。
9)滴加生物素化二抗,20℃～37℃20分钟。
10)PBC洗3次每次2分钟。
11)滴加试剂S**，20℃～37℃20分钟。
12)PBS洗4次每次5分钟。
13)DAB显色：DAB显色试剂盒或者自配显色剂显色（镜下掌握显色程度）。
14)蒸馏水洗。苏木素复染2分钟、盐酸酒精分化。
15)脱水、透明、封片、镜检。
二、 原位杂交操作规程
（一）、仪器设备 医用微波炉； 水浴锅。
（二）、试剂 0.2mol/L HCl：HCl 8.2ml，H20 定容0.5L。
0.1mol/L三乙醇胺(pH8.0):三乙醇胺 5.33ml，H20 定容0.4L。
.5ml/L醋酸-2.5ml/L**:三乙醇胺 13.2ml，NaCl 5g，浓HCl 4ml，H20 定容0.98L，** （用
前加）2.5ml。
20×SSC(pH7.0)：NaCl 175.3g，枸橼酸钠 88.2g，H20 定容1L。
100×Denhardt's：Ficoll 1g，PVP 1g，BSA 1g，H20 定容50ml。
杂交液：Formamide 5ml，20×SSC 2.5ml，Dextran sulfate 1g，100×Denhardt's 0.5ml，10%SDS 0.5ml，10g/L sperm DNA 0.1ml，H20 1.4L。
BufferⅠ（pH7.5）：0.1mol/L Tris·Cl，0.15mol/L NaCl。
BufferⅢ（pH9.5）：0.1mol/L Tris·Cl，0.1mol/L NaCl，0.05mol/L MgCl2。
BufferⅣ（pH8.0）：10mmol/L Tris·Cl，1mmol/L EDTA。
（三）、操作流程
1、使用***标记的核酸探针进行石蜡切片的RNA原位杂交
第一天
1） ***于37℃脱蜡2次，每次15分钟；
2） 无水乙醇浸泡2次，每次3分钟；
3） 95%乙醇浸泡2次，每次3分钟；
4） PBS清洗3分钟；
5） 2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟；
6） PBS清洗10分钟；
7） 加入胃蛋白酶25ul/ml，37℃孵育15分钟；
8） PBS清洗2次，每次3分钟；
9） 0.2N的HCl孵育30分钟；
10）PBS清洗2次，每次3分钟；
11）0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟；
12）PBS清洗2次，每次5分钟；
13）预杂交缓冲液孵育30分钟；
14）准备核酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针，85℃加热5分钟，置于冰块中10分钟；
15）杂交；
第二天
16）将玻片置于SSC中2次，每次5分钟以去除封片；
17）PBS清洗3分钟；
18）RNA酶A溶液中（或0.1-1ng/mlPBS中），37℃孵育30分钟；
19）PBS清洗5分钟；
20）室温，2×SSC清洗10分钟；
21）37℃，1×SSC清洗10分钟；
22）37℃，0.5×SSC清洗10分钟；
23）缓冲液A孵育10分钟；
24）缓冲液A（1%正常绵羊血清和0.03%三重氢核X-100）孵育30分钟；
25）加入抗***抗体（1/200的上述缓冲液，来自Boehringer Mannheim），37℃孵育3 小时；
26）缓冲液A清洗2次，每次10分钟；
27）缓冲液B清洗2次，每次5分钟；
28）制成NBT/BCIP暗处保存30-60分钟，显微镜下进行观察，如果背景尚佳，显色时间可延长到16小时；
29）停止缓冲液B的反应，用水进行简单的清洗；
30）固红，脱水以及封片进行核的复染。

2、使用***标记的寡核苷酸探针进行石蜡切片的原位DNA杂交
第一天
1） ***于37℃脱蜡2次，每次15分钟；
2） 无水乙醇浸泡2次，每次5分钟；
3） 95%乙醇浸泡2次，每次5分钟；
4） PBS清洗5分钟；
5） 2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟；
6） PBS清洗5分钟；
7） 加入胃蛋白酶25ul/ml，37℃孵育10分钟；
8） PBS清洗2次，每次5分钟；
9） 0.2N的HCl孵育30分钟；
10）PBS清洗2次，每次5分钟；
11）0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟；
12）PBS清洗5分钟；
13）预杂交缓冲液孵育30分钟；
14）准备寡核苷酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针；
15）杂交；
第二天
16）将玻片置于SSC中以去除封片；
17）室温，2×SSC清洗10分钟；
18）37℃，1×SSC清洗10分钟；
19）37℃，0.5×SSC清洗10分钟；
20）缓冲液A孵育10分钟；
21）缓冲液A孵育30分钟；
22）加入抗***抗体37℃孵育3小时；
23）缓冲液A清洗2次，每次5分钟；
24）缓冲液B清洗2次，每次5分钟；
25）制成NBT/BCIP暗处保存30-60分钟，显微镜下进行观察，如果背景尚佳，显色时间可长到16小时；
26）停止缓冲液B的反应，用水进行简单的清洗；
27）固红，脱水以及封片进行核的复染。

三、 原位聚合酶链式反应（in situ PCR）和原位反转录聚合酶链式反应（in situ RT-PCR）操作规程
（一）、仪器设备 英国Thermo Hybaid原位PCR仪。
（二）、操作流程
1、原位PCR步骤
1）预处理：
（1）切片常规脱蜡；
（2）0.2mol/L HCl处理10min；
（3）5μg/ml蛋白酶K消化组织37℃10min；
（4）Nase消化组织37℃ 30min；
（5）梯度酒精脱水，室温干燥。
2）原位扩增：
（1）切片滴加特异性序列引物30μLPCR扩增反应液，覆盖硅化盖玻片，石蜡油封边；
（2）PCR热循环：94℃，1min；55℃，1min；72℃，1.5min，共25～30个循环，72℃延伸10min；
（3）***洗去盖玻片，4％多聚甲醛后固定10min，梯度酒精脱水，干燥。
3) 原位杂交：
（1）加***标记探针的杂交液，98℃变性10min，-20℃退火5min，42℃杂交过夜。
（2）杂交后用2×SSC洗涤10min，3次，1×SSC洗涤10min，3次；
（3）缓冲液洗涤10min，3次；
（4）加碱性磷酸酶标记的羊抗***抗体复合物，37℃，2h；
（5）缓冲液洗涤5min，3次；
（6）NBT、BCIP暗处显色，镜下控制，终止显色。
（7）常规脱水：透明、封固。
2、原位RT-PCR步骤
1）预处理：
（1）蛋白酶K(0.3mg/mL) 54℃消化20min，蒸馏水洗；
（2）95℃加热3min，灭活残存的蛋白酶。
2）原位扩增：
（1）在有RNA酶抑制剂存在的条件下，用随机六聚物进行逆转录反应；
（2）用热启动法进行PCR扩增。标本加热至75℃时加上反应液，覆以盖玻片，四周用指甲油密封。然后将温度升至95℃，2min。再将热循环仪设定为95℃，45s，55℃，1min和75℃，45s，共26次循环；
（3）扩增结束后，在80℃烤15min～30min。
3）原位杂交：
（1）杂交前标本95℃加热3min；
（2）加上杂交液，湿盒内50℃过夜；
杂交液组成：25％硫酸葡聚糖，2×SSC，50％甲酰胺，0.33mg/ml变性的鲑鱼**DNA， 每0．5mL杂交液内含生物素标记探针1ng。
（3）扩增的β-肌动蛋白和IL-6用DAKO检测试剂盒K600(链霉卵白素，生物素标记的碱性磷酸酶和硝基四氮唑蓝)检测。阳性反应呈紫色。
3、荧光原位杂交（FISH）和用引物介导的原位标记（PRINS）操作规程
仪器设备
1、 医用微波炉；
2、 水浴锅；
3、 OLYMPUS BX51荧光显微镜；
4、 OLYMPUS DP11数字显微照相机。
FISH试剂
（1）1×PBS：由10×PBS溶液稀释而成，储存于4℃；
（2）20×SSC（pH7.0）；
（3）2×SSC，由20×SSC溶液稀释而成；
（4）25mg/ml蛋白酶K消化液。
（5）变性液(70％甲酰胺+2×SSC，pH7.0)：
4ml 20×SSC；
8ml蒸馏水；
28ml甲酰胺。
每次新鲜配制。
（6）杂交后洗涤液：
20×SSC 4ml；
蒸馏水16ml；
甲酰胺20ml。
每次新鲜配制。调节pH前升至室温。
实验步骤
1、脱蜡：
1）***脱蜡3次，每次5min；
2）100％酒精两次，每次2min；
3）移出酒精，斜置切片，标记末段向下，空气干燥。
2、蛋白酶处理:
1）每个染色缸40ml蛋白酶K消化溶液，配制方法如下：2×SSC 40ml倒人Facal管，在水浴槽中预热。将消化酶液加入管内，摇动直到酶溶解。
2） 37℃水浴槽中预热染色缸和蛋白酶K溶液。37℃孵育20min。
3） ×SSC在室温下漂洗切片3次，每次1min。
4）梯度酒精脱水（-20℃预冷）。
3、变性：
1）每一个立式染色缸配制40ml变性溶液；
2）78℃水浴槽中平衡预热混合液染色缸；
3）78℃孵育8min；
4） 即移入-20℃预冷70%酒精的染色缸内2min，再依次移入80%、90%和100%的-20℃预冷酒精内，每缸2min；
5）空气干燥。
4、杂交：
1）准备探针；
2）取一个较大的湿盒，交叉放置切片；
3）滴10μl探针在切片的组织上，加盖玻片；
4）盖上湿盒盖，37℃孵育12h～16h。
杂交后的水洗：
5）镊子小心去除盖玻片；
6）43℃预热杂交后水洗溶液40ml水洗切片15min；
7）2×SSC(37℃)洗两次，每次10min；
8）切片放入染色缸的1×PBS内待检测，勿使切片干燥。
检测：
9）从1×PBS中取出切片，除去过多的水分，避免标本干燥。把切片放入湿盒内，同时处理4张切片。
10）每张切片使用30μl～60μl罗丹明抗-***抗体或FITC卵白素，室温下孵育20min；
11）去掉塑料盖膜，把切片放入含1×PBS的染色缸。1×PBS室温下洗3次，每次2min。
扩增：
12）从1×PBS中取出切片，斜置切片使液体排出；
13）每张切片滴30μl～60μl抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20min；
14）去掉塑料盖膜，把切片放入含1×PBS的染色缸。1×PBS室温下洗3次，每次2min；
15）从1×PBS中取出切片，斜置切片使液体排出；
16）每张切片滴30μl～60μl抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20min；
17）1×PBS室温下洗3次，每次2min。
5、细胞核染色：
1）张切片加10μl～20μl DAPI，覆盖盖玻片并在室温下孵育2～5ml；
2）尽可能快的在荧光显微镜下观察或封闭盒内保存在-20℃冰箱。切片在染色之后1h内可以在显微镜下观察。
PRINS步骤
1、常规脱蜡浸入0.01mol/LPBS；
2、用0.2mol/L盐酸处理5min；
3、蛋白酶K(25μg/m1)消化37℃ 15min；
4、分别用80％，95％和100％酒精脱水，室温干片；
5、加PCR混合液25μL(10mmol/L Tris-HCl，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2，各加200μmol/L dATP，dCTP，dGTP，1.5mmol/L dig-11-dUTP l.5μl，引物250ng，Taq DNA聚合酶2U)，加盖片；
6、94℃变性5min后置入65℃湿盒中5min；
7、用0.1×SSC液，65℃洗5min；
8、片于65℃ 10s～20s；用4×SSC-0.1％吐温20液42℃洗5min，2次；
9、经Buffer I液洗后滴加20％羊血清封闭30min；
10、加***抗体复合物(1:500)室温下2h；
11、BufferⅢ液洗5min；
12、用BCIP-NBT显色1h～2h，在镜下控制，终止显色；
13、用中性红或核固红衬染，酒精脱水，***透明，树脂封片。

免疫组化问题及解决办法
1、染色过强
原因 解决办法
抗体的浓度过高或抗体孵育时间过长   降低抗体滴度（一般指浓缩性抗体）抗体孵育时间：       室温1小时或4℃过夜
孵育温度过高，孵育温度超过37℃     一般室温20-28℃
DAB显色时间过长或DAB浓度过高   显色时间不能超过5-10分钟，以显微镜下观察为准
2、非特异性背景染色
原因 解决办法
操作过程中冲洗不充分     每步冲洗3×5
组织中含过氧化物酶未阻断   可再配置新鲜3%H2O2封闭，孵育时间延长
组织中含内源性生物素     正常非免疫动物血清再封闭
血清蛋白封闭不充分       延长血清蛋白封闭时间
3、染色弱
原因   解决办法
抗体浓度过低，孵育时间过短   提高抗体浓度，孵育时间不能少于60分钟
试剂超过有效使用期         及时更换试剂
操作中，滴加试剂时缓冲液未沥干，致使试剂稀释   每步滴加试剂前沥干切片中多余的缓冲液（但防止切片干燥）
室温太低，低于15℃ 若室温低于15度，要改放在37℃孵育箱孵育30-60分钟（或4℃冰箱过夜）
蛋白封闭过度             封闭时间不要超过10分钟
4、染色阴性
原因 解决办法
操作步骤错误         重新试验，设立阳性对照
组织中无抗原         设立阳性对照片，以验证实验结果
一抗与二抗种属连接错误 仔细确定一抗与二抗种属无误

目*连

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