【转贴】禽流感病毒的实验室检测

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自2005年10月7日,俄罗斯联邦库尔干州一个大型养鸡场出现禽流感疫情以来,亚洲和欧洲交界处的土耳其、南美国家哥伦比亚、亚洲的泰国、欧洲的希腊爱琴海东部和马其顿等世界各地相继传来禽流感导致禽鸟甚至人类死亡的报告。世界卫生组织(WHO)公布的最新资料显示,从2003年12月底至今年10月,共有118人感染禽流感,其中61人死亡。近来中国湖南、东北等省市也相继出现禽流感疫情,特别是湖南、安徽共确诊了3例人禽流感病例后,面对日益严峻的形势,人们已深刻地认识到,禽流感的传播不仅已经跨越了在禽间传播的界限,而且开始侵袭人类社会,离我们越来越近。为此,各国纷纷推出防范新举措,一场全球防疫战已经打响。


　　禽流感是禽流行性感冒的简称,主要是由甲型禽流感病毒H5和H7亚型中的高致病性毒株所引起的一种禽烈性传染病。人感染禽流感病毒后主要表现为较严重的全身性中毒症状,死亡率较高。人类感染禽流感病毒的主要途径是接触感染,即人接触已感染禽流感病毒的禽类后,病毒通过呼吸道侵入感染者体内,从而造成严重的肺部感染。已知可感染人的禽流感病毒主要有H5N1、H7N7及H9N2亚型。科学家已经确认,今年发生的禽流感大多由高致病性H5N1型病毒所致,其在禽流感病毒亚型中危害最大,禽类感染这种病毒后数日内死亡。如果该病毒由禽类传染给人,人发病后死亡率高达60%。香港在1997年暴发H5N1型禽流感,共有6人死亡。H5N1型禽流感病毒目前还处于由禽鸟传染给人的阶段,尚未发现人间禽流感病毒的传播证据。因禽流感病毒具有较严格的受体特异性,人呼吸道上皮细胞不表达禽流感病毒特异性受体,因而不容易被禽流感病毒识别并结合。然而,如果禽流感疫情反复暴发,一旦病毒基因发生变异,在特定因素作用下,自然界中的禽流感病毒有可能与人流感病毒发生基因重组,从而可能变异为能在人与人之间传播的新型禽流感病毒,这将对人类造成巨大危害。

　　人禽流感的实验室病原学筛查与快速检测对患者的早期诊断、早期控制和及时治疗至关重要,是禽流感防控工作中必不可少的关键环节。目前实验室检测禽流感病毒的病原学方法主要有:病毒培养与分离、病毒核酸RT-PCR或实时定量PCR快速检测、病毒抗原检测以及血清抗禽流感病毒抗体检测。

1. 病毒培养与分离

　　病毒分离是人禽流感诊断的金标准,通常采用鸡胚和狗肾上皮细胞(MDCK),留取人禽流感疑似患者的鼻咽拭子或含漱液、肺组织、气管分泌物进行病毒的培养与分离。检测时间需要一周以上。

2. 病毒核酸检测

　　用RT-PCR、实时定量PCR、PCR产物测序可快速特异地检测禽流感病毒亚型特异性H抗原基因。样本留取同病毒培养,可在4小时内完成检测,是目前对初筛实验室早期筛查推荐采用的方法。

3. 病毒抗原检测

　　取患者呼吸道标本,采用免疫荧光法或酶联免疫吸附法(ELISA)检测甲型流感病毒[根据相关法规进行屏蔽]白(NP)抗原及禽流感病毒H亚型抗原。

4. 血清学检测

　　主要有血凝抑制试验、微量中和试验,以及发病初期和恢复期双份血清抗禽流感病毒抗体的ELISA检测。其中血凝抑制法获得结果快,只需两天,但敏感性低,且易于其他流感病毒呈阳{BANNED}叉反应。微量中和试验敏感性高,确诊意义大,但需要10天以上时间。这些试验都需采集患者血清,主要用于病毒抗原性、流行病学分析和回顾性诊断。

　　实验室在进行禽流感检测工作的整个过程中,特别应该把握以下几个关键环节:

1. 采[根据相关法规进行屏蔽]格标本最重要

　　及时采集咽拭子和血清两类标本。咽拭子的最佳采集时间是病人发病后的3~4天,血清标本的采集,需要在患者急性期和恢复期进行,只有通过对患者急性期和恢复期双份血清检测结果的对比,才能够准确判定患者是否感染了禽流感。如患者死亡,只要有可能,最好采集其肺组织标本。各类样本的采集均应由受过专门培训的人员严格按照样本采集规范进行留取。

2. 检测技术要规范

　　要确保对可疑病例做出正确的判断,就必须保证在检测过程中的每一个实验步骤都严格按照操作规范进行。采用的检测试剂必须经国际或国家相关机构认可,检验人员需接受专门技术培训,发出报告的流程应严格按照国家或当地权威部门所制定的网络实验室报告流程进行。

3.确保实验室生物安全

　　由于禽流感病毒,特别是H5N1型病毒的致病性高,因此,必须确保不同的实验在相应生物安全级别的实验室内完成。如病毒分离和微量中和试验必须要在生物安全三级实验室内完成,其他实验应在生物安全二级实验室进行,操作人员应采用生物安全三级防护。此外,还要对用过的标本和物品进行消毒、销毁或保存。禽流感病毒对**、***和丙酮等有机溶剂均敏感。常用消毒剂容易将其灭活,如氧化剂、稀酸和卤素化合物(漂**和碘剂)等都能迅速破坏其活性。禽流感病毒对热比较敏感,但对低温抵抗力较强,65℃加热30分钟或者煮沸(100℃)2分钟以上可灭活。病毒在较低温度粪便中可存活1周,在4℃水中可存活1个月。病毒对酸性环境有一定抵抗力,在pH4.0的条件下也具有一定的存活能力,在有甘油存在的情况下可保持活力1年以上。**的病毒在阳光直射下40~48小时即可灭活,如果用紫外线直接照射,可迅速破坏其活性。

　　WHO、国家卫计委以及中国疾病预防与控制中心(CDC)已及时发布了《人禽流感诊疗方案(2005修订版)》(详见本报第6版)、《禽流感实验室检测技术方案》等一系列指导性文件,对实验室安全、样本采集、运送、检测、保存和处理等各个环节作出了具体明确的要求和规范,以确保实验室技术人员的操作安全,同时保证检测结果的准确性和及时性。为了做到信息准确、报告及时,北京市还制定了《北京市人禽流感网络实验室工作方案》,确定了北京市初筛实验室12家、一级复核实验室6家、二级复核实验室1家,并对各类实验室相应的工作职责、工作流程、技术规范和生物安全保证作出了具体细致的指导。相信在[根据相关法规进行屏蔽]和广大专业人员的共同努力下,人禽流感的防控工作一定能卓有成效地进行。

[根据相关法规进行屏蔽]第302医院临床检验中心 毛远丽

摘自《中华医学***报》