【推荐】实验室在辅助生殖医学中的作用

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作者：Linda C Rogers，PhD
辅助生殖医学领域是一相对较新的医学专业，1959年诞生了第1例“试管动物”（兔子）。随后实验迅速由动物进展至人类。体外受精（In vitro fertilization，IVF）是第一个发展起来的辅助生殖技术。1978年7月28日英国首例体外受精诞生了路易斯 布朗（Louise Brown）。1981年美国首次应用IVF。此后IVF方法学作了改良和优化。美国已有超过114,000婴儿是采用IVF技术出生的。
按照美国疾病控制和预防中心（CDC）的规定，辅助生殖技术（assisted reproductive technologies, ART）包括运用卵子和**的所有生育力治疗方法。一般说来，ART方法包括：
通过外科手术取出卵母细胞
在实验室内卵母细胞与**结合受精
胚胎移植至妇女子宫或捐赠给其他妇女
受精可采用实验室体外受精或妇女子宫内受精。

不育症的诊断
不育症简单定义为双方有正常的性生活并且不采取避孕措施、但一年后不能怀孕或出现死胎。美国不育症患者约有6百余万——占生育年龄的10%。不育与女性、男性或双方均有关，亦有原因不明者。
实验室检查对诊断男性和女性不育症起着关键作用。男性检查包括**分析、抗**抗体测定、血激素水平测定。**分析可区分**数量、形态或**活动力的异常。抗**抗体可测定**的自身免疫，有报道称不育症男性中有10%会出现抗**抗体，而有生育力的男性出现的比例<1%。采用卵母细胞单**微注射技术（ICSI）、即将**直接注入卵母细胞浆内可达到成功受精。激素分析包括睾酮、泌乳素（PRL）、黄体生成素（LH）和促卵泡激素（FSH）。这些激素之间的相互关系对正常**的产生是重要的。一种或多种激素异常有助于判定出现问题的部位（睾丸、垂体或下丘脑）。
女性的评估范围更广，包括排卵监测、子宫和输卵管的X射线照相术、腹腔镜检查直接观察生殖器官和子宫内膜活检。初步实验室分析包括检测促甲状腺激素（TSH）、游离甲状腺（FT4）以确定甲状腺功能，检测FSH、LH、PRL以评价下丘脑和垂体功能，检测硫酸脱氢表雄酮（DHEA—S）和睾酮（总睾酮和游离或生物活性睾酮）以排除高雄性激素血症。另外还可在月经周期的特殊时间进行激素分析，如在周期第3天测FSH和雌二醇（E2）以评估卵巢的储备。检测LH和PRL用有以评估卵泡期，在黄体中期测孕酮来评估排卵功能。
ART程序
一个ART周期所采用的步骤包括（详见表1）：
测卵巢的储备；
用外源性**控制卵巢过度**；
注射人hCG诱导排卵（诱导卵细胞最后成熟）；
收获卵母细胞（卵母细胞获得）；
卵母细胞受精；
胚胎移植。

表1. ART周期的步骤          
1．        受控制的卵巢**
2．        随访和评估卵泡生长、发育
3．        诱导排卵
4．        卵母细胞的获得
5．        卵母细胞的体外成熟
6．        体外受精
7．        胚胎培养
8．        胚胎移植9．       
10．        妊娠
         

卵巢储备的测定
卵巢储备是测卵巢功能的一种方法，称为“生殖潜能”（reproductive potential）。每一个女性出生时有固定的卵母细胞。卵泡数和卵巢功能随年龄而下降，而FSH水平则随卵巢功能降低而增加。FSH是卵巢储备最常用的标志物。在周期第3天FSH的水平就可反应卵巢储备和剩余卵母细胞的质量。月经第1天是月经周期开始日。卵巢早衰发生于月经周期规则的绝经期前妇女，可影响其生育。周期第3天FSH升高是缺乏**后果的早期警告，其妊娠率极低，因而用作女性考虑ART的预测指证。其水平是预测卵巢对**治疗的反应和妊娠的概率。FSH低水平的病人经**后可产生足够数量的卵母细胞；相反，FSH高水平的病人不宜作卵巢**。这类病人应考虑用献卵者的卵细胞作ART周期，而不是通过不能成功的**治疗。周期第3天的FSH测定对协商安排夫妻生育方案及作IVF选择是有价值的。
周期第3天测E2可评估卵巢储备。抑制素B（inhibinB）和抗副中肾管激素亦可用作卵巢储备的评估。随着自动化分析的进展，这些检测会得到更广泛的应用。

卵巢**的控制
虽然第一例IVF婴儿采用了自然周期，但采用过度**卵巢产生多个卵泡可使经历ART夫妇的妊娠率大大增加。此法可获取多个卵细胞，用于受精和移植至子宫。因而卵巢**控制的目的是从多个卵泡中获取高质量的卵细胞，可采用药物或数种药物结合来达到这一目的。由于对这些药物的反应不同，因而卵巢**需要个性化处理。
大多数治疗方案采用**释放激素激动剂来抑制垂体，采用测E2水平以保证抑制充分，此时亦应测FSH和LH。垂体抑制后再用卵巢**药物。通过检测E2水平和卵巢超声检查可密切监测**的卵巢周期；此外还可进行宫颈粘膜检查以及孕酮和LH测定。在治疗周期内监测E2水平的主要目的是控制卵泡成熟、检测不良的卵巢反应、相应地调整用药、安排注入最终激发卵细胞成熟的hCG的时间、预测周期的结果和筛查卵巢过度**综合证（Ovarian hyperstimulation syndrome ,OHSS）。
卵巢**后，E2水平最初的上升可用以测定卵巢反应。可以根据E2水平调节**药物的剂量。治疗方案继续阶段应定期检测E2水平并与**B超结合测定发育卵泡的大小、成熟度和数量。从应用**药物开始（第1天）至引起排卵这段时间里，通常应在3、5、7、9和11天检测E2水平。每一成熟卵泡约产生200pg/ml—250 pg/ml的LH，此值可因检测方法的不同而有所变化。E2水平和超声数据的结合可用于测定诱导排卵和卵母细胞获取的时间。此时“优势”卵泡大小为17mm—18mm、E2水平符合成熟。

卵巢**的并发症
ART的最严重的并发症之一是卵巢过度**综合征（OHSS）。OHSS可导致卵巢周期取消和/或住院治疗。E2水平可用于监测病人的OHSS。OHSS可从轻度卵巢肿大至严重的多器官衰竭，每45,000到50,000个不育症妇女中约出现1例死亡。OHSS的病理机制尚不完全清楚。严重OHSS的危险因子包括年轻、瘦弱、E2水平较高和大量卵泡。OHSS的基本特征是肿大的多囊卵巢、全身血管渗透性增加和血管内液体流失。轻度至中度OHSS可在门诊治疗，而重度OHSS妇女则必须住院治疗。重度OHSS治疗的目标是恢复血管内血容量、逆转已发生的血浓缩和维持尿液的排出。对有卵巢扭转、异位妊娠或囊肿破裂指征的OHSS患者需进行外科治疗。
综合征的预防是一个主要目标，通过个体化的排卵**治疗方案和基于E2水平升高情况尽早取消卵巢周期将有助于减少其发生率。

诱导排卵
注射由尿中提纯的hCG可诱导排卵。由于其类似LH，因而hCG被用于激发排卵、黄体化和支持黄体。注射重组hCG具有类似LH峰的作用。
大多数诊所在注射hCG前会抽取血液测孕酮以评估黄体状况。孕酮水平是黄体化的一种反应，孕酮升高提示子宫环境尚未达到进形成功移植和妊娠的最佳状态。卵细胞获取、体外受精和胚胎移植前的过早黄体（premature luteinization PL）对胎儿存活是有害的。孕酮升高的患者在更适合的周期里采用冷冻保存的胚胎移植至子宫获得妊娠的成功率更大。

卵细胞的获得
hCG注射后34-36小时，病人用镇静剂在B超下用针经**取卵母细胞，而后穿刺卵泡、去除卵泡液，卵细胞在严格条件下置培养液中培养。

受精
从一新鲜**样本中采集50，000-100，000个活动**加至每个卵细胞，孵育过夜。次晨检查卵细胞受精状况。**质量严重受损或男子不能**时，可进行卵细胞胞浆内注射**以保证卵细胞受精。此法系用单个**直接注入卵细胞。受精后密切监测胚胎发育，48小时的胚胎为4细胞期。
胚胎移植前的遗传学诊断：IVF中，遗传学异常是胚胎移植失败的主要原因。移植前遗传学诊断（PGD）是采用遗传学分析来自一个8细胞胚胎的单一细胞以决定它是否正常和适合移植于子宫。这对双亲是严重遗传性疾病如囊性纤维化、肌营养不良、镰形红细胞性贫血、泰萨二氏病（Tay-Sachs disease）和马方氏综合征（Marfan’s syndrome）的携带者而言尤其重要，因为这可以避免子女再罹患这些令人伤心的遗传性疾病。采用PGD最常见理由是使不育症双亲改进胚胎选择以最大限度的保证获得胎儿存活的妊娠。

胚胎移植
受精72小时内，胚胎通过一根导移植至子宫。此后推荐卧床休息2天，成功移植的周期约为3.5天。可经**塞药、注射或微粉化口服方式补充孕酮。应定期监测孕酮水平以便作剂量调整。
妊娠监测：胚胎移植后10-12天采血作hCG定量检测，如结果阳性（即表示妊娠），则测孕酮和hCG以监测早期妊娠。
通常这些患者在完成试验分析和作出决定前不能离开诊所。

实验室支持ART的指南
一个ART周期中要进行很多实验室分析。ART周期常用的试验（表2）最少包括：
表2. ART实验分析概要

分期/阶段        实验室试验          
不育症评估        E2、孕酮、LH、FSH、PRL、DHEA-S、睾酮、TSH 、FT4、**分析          
卵巢**        E2、孕酮          
诱导排卵        孕酮          
卵母细胞获取        无          
移植后        孕酮          
妊娠监测        hCG         

1．ART前：不育症的最初检查包括E2、孕酮、LH、FSH、睾酮、DHEA-S、TSH 、FT4和正常周期第3天的血FSH水平。
2．ART周期期间：卵巢**期E2水平，hCG使用当天的孕酮水平和**分析。
3．ART周期后：孕酮水平，hCG检测
生育诊所通常采用数目少但却是非常重要的实验室检测项目单。实验结果的正确、可靠、重复性好和及时性对生育的成功至关重要。

检测项目单
为有效的支持ART诊所，实验室必须能提供虽小但特异的激素测定组合。这些组合包括确定不育症的基本组合、ART过程中应用的关键检测项目以及成功的ART周期的随访（如妊娠）。最少检测项目包括TSH、FT4、LH、FSH、E2、孕酮、PRL、睾酮、DHEA-S和hCG。
ART期间3种最重要检测项目是FSH、E2和孕酮。
这些试验在辅助生殖的特殊时间进行，重要的决定要依靠这些试验结果作出，因而方法的正确性、精确性、可靠性和快速的报告结果是基本条件。

结果报告时间
结果报告时间对生育诊所是很重要的。很多患者在就诊时抽血进行分析，然后根据试验结果作出治疗调整或其他重要决定。一般来说这些患者在试验结果出来之前不能离开诊所，因而及时获得第一个试验结果是实验室支持ART的一个重要参数。

分析范围
一个试验的检测范围与总的结果报告时间有明显关系。超出检测范围的结果需要技术员将样品稀释后再检测，这将导致分析时间增加一倍。分析范围越宽则可减少因样品浓度高而需稀释后再测定的时间。

分析的结果为何有差异？
免疫测定在很多情况下结果会有差异。这些差异可因标准品、试剂使用的抗体和/或测定终端产物的方法不同而造成。这些差异对应用这些实验结果对ART作出重要决定的医师是个考验。通常此类决定包括预后因素的解释、决定合适的药物剂量、获取卵细胞和胚胎移植的时间选择等。

质量差的实验室检测造成的后果
质量差的实验室检测工作对IVF的成功会造成很大影响。不可信赖的FSH水平可导致预后指征和药物选择治疗方案的错误。E2检测对药物剂量调整和及时获取卵细胞非常重要，如检测结果不可信则可导致不能怀孕及相应的精神痛苦和经济损失。IVF一个周期费用要数千美元。

与医师交流
新的试验结果报告前如有任何改变实验室必须通知医师。要让医师知道预计有什么改变及何时改变。如果医师需要更详细资料，则应保留有效的相关数据。
下列步骤可帮助医师提前理解和准备试验结果的改变：
通知医师测定方法改变和实验室的执行计划。
提供预先确定时间的新、老测定方法一致的试验平台
制定用于老和新的方法有效校正数据
分发有关的支持材料，包括：
a.        与老方法相关的数据
b.         重要检测项目的试验指c.        南（FSH、E2和孕酮）
d.         新方法学的证据来源（如文献转载）。

努力与成功
健康配偶之间任何一个月的正常妊娠机会是20%-25%。按最近CDC统计，获取卵细胞的IVF成功率是29.4%。这一成功率需要精良的医学方法和医术高超的医师。并发症是会发生的，特别是多胎的情况下。异位妊娠发生率略高于非辅助妊娠（表4）。
表4. ART的并发症

2000年多胎生育
   ART生育35%，而正常生育<3%
其中双胎率：30.7%
   3胎发生率：4.3%
异位妊娠
   发生率仅轻度增加
   ART生育的为1%-2%
   正常生育的为2%-3%          
2000年辅助生殖成功率（CDC）         

不育夫妇往往要遭受体力、情感和经济等的多重压力。临床实验室及时、可靠、精确和正确的检测结果使其在这一医学领域内扮演着重要角色。

参考文献（略）

作者简介：Linda C Rogers，PhD，D**C，FACB，美国Beckman Coulter公司市场开发部经理。