细胞原代培养

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细胞原代培养

一、原理
    将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。   
二、仪器、材料及试剂
    仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃）
    材料：胎鼠或新生鼠
    试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank’s液，碘酒
    三、操作步骤
    （一）胰酶消化法
    1、器材：将孕鼠或新生小鼠拉颈椎致死，置75%酒精泡2—3秒钟（时间不能过长、以免酒精从口和**浸入体内）再用碘酒消毒腹部，取胎鼠带入超净台内（或将新生小鼠在超净台内）解剖取肝脏，置平皿中。
    2、用Hank’s液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。
    3、用手术剪将肝脏剪成小块（1mm2），再用Hank’s液洗三次，转移至小青霉素瓶中。
    4、视组织块量加入5—6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20—40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。
    5、加入3—5ml培养液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。
    6、静置5—10分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。
    7、1000rpm，离心10分钟，弃上清液。
    8、加入Hank’s液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。
    9、加入培养液l—2 ml（视细胞量），血球计数板计数。
    10、将细胞调整到5×105/ml左右，转移至25ml细胞培养瓶中，37℃下培养。
   上述消化分离的方法是最基本的方法，在该方法的基础上，可进一步分离不同细胞。细胞分离的方法各实验室不同，所采用的消化酶也不相同（如胶原酶，透明质酶等）。
    （二）组织块直接培养法
    自上方法第3步后，将组织块转移到培养瓶，贴附与瓶底面。翻转瓶底朝上，将培养液加至瓶中，培养液勿接触组织块。入37℃静置3—5小时，轻轻翻转培养瓶，使组织浸入培养液中（勿使组织漂起），37℃继续培养。
    四、注意事项
    1、自取材开始，保持所有组织细胞处于无菌条件。细胞计数可在有菌环境中进行。
    2、在超净台中，组织细胞、培养液等不能暴露过久，以免溶液蒸发。
    3、凡在超净台外操作的步骤，各器皿需用盖子或橡皮塞，以防止细菌落入。
    五、无菌操作的几个注意事项
    1、操作前要洗手，进入超净台后手要用75%酒精或0.2%新洁尔灭擦试。试剂等瓶口也要擦试。
    2、点燃酒精灯，操作在火焰附近进行，耐热物品要经常在火焰上烧灼，金属器械烧灼时间不能太长，以免退火，并冷却后才能夹取组织，吸取过营养液的用具不能再烧灼，以免烧焦形成碳膜。
    3、操作动作要准确敏捷，但又不能太快，以防空气流动，增加污染机会。
    4、不能用手触已消毒器皿的工作部分，工作台面上用品要布局合理。
    5、瓶子开口后要尽量保持45°斜位。
    6、吸溶液的吸管等不能混用。

    附：Hank’s液配方：
    KH2PO4 0.06g，Nacl 8.0g，NaHCO3 0.35g，KCl 0.4g，葡萄糖1.0g，Na2HPO4·H2O  0.06g，加H2O至 1000ml
注：Hank’s液可以高压灭菌。4℃下保存


  对于“附：Hank’s液配方：
    KH2PO4 0.06g，Nacl 8.0g，NaHCO3 0.35g，KCl 0.4g，葡萄糖1.0g，Na2HPO4·H2O  0.06g，加H2O至 1000ml
注：Hank’s液可以高压灭菌。4℃下保存”不敢苟同。因为葡萄糖在高温下会分解，还会产生沉淀，加入葡萄糖的HANKS液应该过滤消毒。不加则可高压消毒。