循环肿瘤细胞在胰腺肿瘤中的检测和临床应用——吕洋 浦宁 许雪峰 等

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吕洋 浦宁 许雪峰

通信作者:许雪峰

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中华消化外科杂志2016年10月第15卷第10期1033-1036页

[size=1em]作者单位

复旦大学附属中山医院普通外科  

复旦大学普通外科研究所

摘      要

胰腺肿瘤是消化道常见肿瘤,其诊断､治疗及预后判断较为困难｡循环肿瘤细胞(CTCs)的检测是近年来的研究热点,且在许多肿瘤中已被证实对诊断､治疗及预后具有提示作用｡本文针对CTCs现有的富集､检测方法及其在胰腺肿瘤诊断与治疗中的研究进展进行概括､总结并提出CTCs的应用前景｡

关  键  词

胰腺肿瘤; 循环肿瘤细胞; 诊断; 治疗; 预后

近年来,消化系统恶性肿瘤成为全世界最多发的恶性肿瘤,如胰腺癌､肝癌､食管癌､胃癌､结直肠癌等,严重威胁人类健康;其中,胰腺肿瘤患者预后最差｡据Chen等[1]的统计, 中国胰腺肿瘤发病例数和病死例数分别居全世界第10位和第7位｡筛查､诊断与治疗胰腺肿瘤的临床水平已明显提高,但高复发转移率依旧是患者死亡的主要原因｡探求更有效的胰腺肿瘤早期预测和疗效评估手段是目前研究的热点和难点｡

目前外周血循环肿瘤细胞(circulatingtumor cells,CTCs) 的检测及临床应用是一项热点技术｡有效检测CTCs的数量及标记物表达,对评估消化系统恶性肿瘤患者的临床病理特征､抗肿瘤治疗疗效及预后有重要意义,还可作为潜在的分子治疗靶点｡已有大量研究结果证实:CTCs对乳腺癌､结肠癌及前列腺癌患者术后肿瘤复发和转移有提示作用[2-3]｡胰腺肿瘤的CTCs检测及临床应用尚未广泛研究｡

1 CTCs应用现状

CTCs是一类从原发肿瘤灶中脱落,进入血液循环的细胞,其通过循环系统到达远处器官,这是肿瘤转移的基础[2]｡CTCs主要通过两种方式进入血液:(1)从原发肿瘤灶中被动脱落,此过程脱落的肿瘤细胞数量居多,且发生于肿瘤形成早期[4]｡(2)从肿瘤上皮组织向间叶组织主动迁移,是非常复杂的分子过程,且可能使上皮细胞失去原有特性,获得间叶组织细胞特性,如良好的细胞迁移性及抗凋亡性等[5-6]; 其被认为是肿瘤侵袭和转移播散的主要机制｡CTCs具有异质性,可能导致CTCs间的差异[7-9]｡多数CTCs在血液循环中死亡,仅有约0.01%存活并产生远处转移[10]｡存活的CTCs可能在很长时间内处于非增殖状态,并可抵抗化疗药物的抗肿瘤作用[11]｡因此,从理论上而言,在细胞及肿瘤微环境层面上,CTCs的检测对肿瘤的诊断､治疗及预后均有提示作用｡

2 CTCs的富集与检测

  高效提取CTCs需采用具有高灵敏度和特异度的检测手段｡检测CTCs的前提是对循环系统中的CTCs进行富集[12]｡经典的富集方法是密度梯度离心分离法,将单核细胞(包括肿瘤细胞)在等渗介质下富集､分离(采用Lympho PrepTM淋巴分离液和Oncoquick?分离离心试管等)｡由于CTCs普遍比外周血WBC大,故根据CTCs大小设计的隔膜渗滤富集技术同样存在,其中最常见的膜微型滤过设备是通过上皮肿瘤体积分离技术(the isolation by size of epithelial tumor,ISET)[13]｡近年来,还有一些其他基于同样原理的检测设备问世[14-17]｡

  通过免疫磁性机制富集CTCs也是近年来较热门的技术,其采用一种或一系列特异性抗原,捆绑细胞表面特异性蛋白,实现富集､分离｡由于CTCs表面特异性抗原尚未被发现,故常采用上皮细胞特异性蛋白分离､检测CTCs,其中上

皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)最常用[18-19]｡阴性选择的常用抗原是WBC特异性抗原CD45[19]｡特异性抗体通过免疫磁珠或流式细胞被固定,而后根据各自机制富集细胞[20-21]｡目前常用的免疫磁珠分离系统有magnetic-activated cell sorting系统､Easy Sep-cell separation系统､cell isolationby Dynabeads系统和the Cell Search 系统｡其中the Cell Search系统是唯一被美国食品药品监督管理局(FDA)批准用于CTCs检测的系统,且已被证明其检测阳性结果与多种恶性肿瘤临床特征密切相关｡流式细胞分离系统包括CTCs芯片､“人字形”芯片(herringbone-chip, HB-chip)､MagSweeper技术､电泳域-流分离法､空间强化差异的免疫捕获技术及微流控装置[21-24]｡

CTCs的检测主要基于免疫细胞化学法和聚合酶链式反应｡免疫细胞化学法中,需要将被分析的细胞固定以便于操作｡细胞固定后,采用一种或几种抗体将其着色,根据抗体的上皮细胞特异性蛋白,一般为细胞角蛋白(cytokeratin, CK),显示CTCs表达情况｡此外,WBC特异性抗体可降低假阳性率｡着色常采用具有可探测标签的抗体(如荧光微粒等),细胞通过酶标染色或荧光染色方法显像｡CTCs通过光学显微镜或荧光显微镜计数｡常用免疫细胞化学法包括the CellSearch系统及EPISPOT系统[25-26]｡其他采用免疫荧光标记检测CTCs的方法有FAST系统及Cytotrack技术[27]｡

  基于聚合酶链式反应的CTCs检测技术常利用可在CTCs中作为标记物且高表达的一类mRNA｡由于缺乏肿瘤细胞特异性mRNA,上皮细胞特异性mRNA常被用于CTCs 的检测｡这类转录因子在正常血细胞中也有表达,虽水平较低,但仍需将正常血细胞表达的最高水平作为CTCs检测的最低临界值｡常用方法有RT-PCR等[28]｡

3 胰腺肿瘤中CTCs的检测

3.1 胰腺癌CTCs的检测及临床应用

3.1.1 CTCs的早期检测及应用:与乳腺癌､结直肠癌比较, 关于胰腺癌CTCs的检测报道较少[29-30]｡早在1999年, Chausovsky等[31]采用RT-PCR检测28例胰腺癌患者外周血样本,发现有22例患者的CK20扩增,提示CK20mRNA可作为替代标记物,用于胰腺癌患者外周血CTCs的检测｡而后于2001年,Z′graggen等[32]采用免疫细胞化学法分析105例胰腺癌患者(其中不可切除73例,可切除32例)及66例健康对照者的外周血和骨髓样本,不可切除和可切除胰腺癌患者中分别有32.9%(24/73)和9.4%(3/32)检测出CTCs,两者比较,差异有统计学意义(P<0.05);胰腺癌患者与健康对照者比较,差异无统计学意义(P>0.05);但仍提示CTCs阳性与胰腺癌进展有一定关系｡2004年,Allard等[25]采用the CellSearch系统分析964例转移癌(12种不同类型)患者､199例良性肿瘤患者及145例健康对照者外周血样本,其中16例转移性胰腺癌患者中,6/16出现CTCs阳性,4例患者CTCs数目>2个,2例患者CTCs数目>5个;且12种转移癌中,胰腺癌患者CTCs水平最低[25]｡

2004年,Mataki等[33]分析20例行胰腺癌根治术患者的外周血样本,术后每3个月取1次外周血样本,采用密度梯度离心分离法富集,以CEA mRNA为替代标记物,采用RT-PCR检测CTCs;随访过程中,6/20CEAmRNA阳性,其中5/6肿瘤复发,提示CTCs的随访检测可能有助于胰腺癌预后的监测｡2005年,Soeth等[34]回顾性分析172例不同分期的胰腺癌患者外周血和骨髓样本,采用CK20RT-PCR检测散在肿瘤细胞和CTCs,30.2%(52/172)CK20阳性;单因素分析结果显示:散在肿瘤细胞阳性和CTCs阳性是影响患者总体生存时间的相关因素(P<0.05)｡2007年,Nagrath等[35]首次报道了采用CTCs芯片富集､检测15例发生转移的胰腺癌患者外周血样本,均检测出CTCs阳性,数目为9~831个;20例健康对照者无一例CTCs阳性｡2007年,Hoffmann等[28]以CK19 mRNA为替代标记物,采用RT-qPCR检测37例胰腺癌患者外周血､骨髓､腹腔灌洗液样本,64.9%(24/37)CK19阳性,但CK19阴性患者生存时间并无明显优势｡之后,Kurihara 等[36]采用theCellSearch系统检测26例胰腺癌患者外周血样本,11例CTCs阳性且中位生存时间差于CTCs阴性患者, 差异有统计学意义(P<0.05)｡

3.1.2 近年CTCs的检测及应用:2011年,Ren等[37]采用免疫细胞化学法检测41例Ⅲ期胰腺癌患者接受辅助治疗前和行5-氟尿嘧啶辅助化疗1个疗程后1周的外周血样本,33例患者2次检测CTCs均为阳性｡同年,Zhou等[38]采用免疫磁性机制富集､RT-PCR检测25例胰腺癌患者外周血样本,分别以人体端粒酶反转录酶mRNA､C-METmRNA､CK20mRNA和CEAmRNA作为替代标记物,其表达率分别为100.0% (25/25)､80.0%(20/25)､84.0%(21/25)和80.0%(20/25)｡Sergeant等[39]采用EpCAM mRNA作为替代标记物,检测48例胰腺导管腺癌患者(40例可切除,8例不可切除)术前､术中及术后外周血和腹腔灌洗液样本,发现术后CTCs水平一过性急剧升高,术后1d下降至术前水平｡40例可切除患者中,术前10例EpCAMmRNA阳性,术后当日27例EpCAM mRNA阳性,术后6周8例EpCAM mRNA阳性｡2012年, Marrinucci等[40]采用流体技术检测胰腺癌患者外周血样本, 其结果显示:50%的胰腺癌患者CTCs阳性｡同年,Khoja 等[41]的研究结果显示:在进展期转移的胰腺癌患者外周血样本CTCs检测中,ISET系统与theCellSearch系统比较,前者具有更高的阳性检出率和特异度,且在描述CTCs特性方面具有更高的灵敏度｡deAlbuquerque等[42]以一种包括CK19､黏蛋白1､EpCAM､癌胚抗原细胞黏附分子5和BIRC5 [A1]的mRNA组为替代标记物,采用免疫磁性机制富集､RT-PCR检测胰腺癌患者外周血样本,其结果显示,47.1% (16/34)的胰腺癌患者检测出≥1个的标记物阳性,且CTCs 阳性患者无进展生存时间更短(P<0.05)｡近年来,Gall等[43]和Bidard等[44]分别通过LAP07实验验证了CTCs的检测对于局部晚期胰腺癌患者预后具有潜在提示作用｡

Kulemann等[45]分析11例胰腺导管腺癌患者和9例健康对照者外周血样本,其结果显示:8例患者CTCs阳性,健康对照者均为阴性｡G?rner等[46]流水线式检测胰腺癌患者外周血样本CTCs并建立基因表型,使CTCs量化与基因分析相结合｡

  胰腺癌患者CTCs检测的临床意义仍不明朗,部分研究证实CTCs阳性与患者预后具有相关性,而部分研究并未得出此结论｡此外,许多研究由于样本量过小,导致证据级别不足｡因此,探索CTCs对于胰腺癌患者的临床意义仍需更多高级别研究证据支持｡

3.2 胰腺内分泌恶性肿瘤CTCs的检测

  胰腺内分泌肿瘤发病率相对较低,但近年来,随着实验室及影像学检查技术的进步和临床医师经验的积累,其检出率也明显升高[47]｡关于胰腺内分泌肿瘤CTCs的检测研究很少｡2011年Khan等[48]采用theCellSearch系统检测79例转移性神经内分泌肿瘤患者(包括19例胰腺神经内分泌肿瘤患者)外周血样本,16例胰腺神经内分泌肿瘤患者EpCAM mRNA阳性,且CTCs阴性患者疾病进展更缓慢(P<0.05)｡2013年Khan等[49]的研究结果显示:G1期和G2期胰腺神经内分泌肿瘤患者CTCs阴性可能提示更长的疾病无进展生存时间和总体生存时间｡

3.3 胰腺良性肿瘤CTCs的检测

  胰腺良性肿瘤(如胰腺浆液性囊腺瘤等)一般预后良好, 早期诊断并行根治性手术后复发转移率非常低,此类患者CTCs检测及预后的评估灵敏度和特异度很低,故目前缺乏相关大样本量研究｡

4 小结

  在胰腺肿瘤及其他肿瘤CTCs的检测中,技术不统一, CTCs计数及阳性标准不均一导致不同检测系统得出不同结果,则研究数据本身就存在统计学偏倚｡尽管the Cell Search 系统是目前应用最广泛的CTCs检测系统,但仍不能替代其他技术成为统一的检测系统｡

  总之,胰腺肿瘤CTCs的检测对患者早期筛查､手术效果评价､放化疗疗效评价､耐药性检测及预后判断具有潜在临床价值,其还可作为一种潜在的分子治疗靶点,具有广阔的应用前景,值得深入研究及临床推广｡