同时性结直肠癌肝转移结直肠癌组织中Kiss-1蛋白和基质金属蛋白酶9蛋白的表达及意义

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同时性结直肠癌肝转移结直肠癌组织中Kiss-1蛋白和基质金属蛋白酶9蛋白的表达及意义——惠菲菲 刘凯 杨家和 等

中华消化外科杂志2016年2月第15卷第2期153-160页

作者单位

济宁市第一人民医院普通外科

第二军医大学附属东方肝胆外科医院腹腔镜科

摘      要

目的 探讨同时性结直肠癌肝转移(SCRLM)患者结直肠癌组织中Kiss-1蛋白和MMP9蛋白的表达及其与SCRLM患者临床病理因素和预后的关系,以及两者表达的相关性｡ 方法 采用回顾性病例对照研究方法｡收集2000年1月至2013年5月第二军医大学附属东方肝胆外科医院收治的96例SCRLM患者和69例无转移结直肠癌患者的临床病理资料｡收集96例SCRLM患者手术切除的结直肠癌组织及其中50例癌旁组织(距离阴性切缘≥5cm);69例无转移结直肠癌患者手术切除的结直肠癌组织进行研究｡采用免疫组织化学染色检测Kiss-1蛋白和MMP9蛋白的表达情况｡通过门诊和电话方式随访患者的生存情况,随访时间截至2014年8月｡计数资料的比较及SCRLM患者结直肠癌组织中Kiss-1蛋白和MMP9蛋白表达与患者临床病理因素的关系采用χ2检验或Fisher确切概率法｡采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线,采用Log-rank检验进行生存分析｡相关性分析采用Pearson等级相关分析｡ 结果 Kiss-1蛋白的表达位于组织细胞的细胞质,其阳性表达率在SCRLM患者结直肠癌组织､无转移结直肠癌患者的结直肠癌组织､SCRLM患者结直肠癌旁组织中分别为24.0%(23/96)､43.5%(30/69)､52.0%(26/50),3者比较,差异有统计学意义(χ2=14.307,P<0.05)｡其中SCRLM患者结直肠癌组织中Kiss-1蛋白的阳性表达率分别与无转移结直肠癌患者的结直肠癌组织和SCRLM患者结直肠癌旁组织比较,差异均有统计学意义(χ2=0.702,11.594,P<0.05);无转移结直肠癌患者的结直肠癌组织与SCRLM患者结直肠癌旁组织比较,差异无统计学意义(χ2=0.845,P>0.05)｡MMP9蛋白的表达位于组织细胞的细胞质,其阳性表达率在SCRLM患者结直肠癌组织､无转移结直肠癌患者的结直肠癌组织､SCRLM患者结直肠癌旁组织中分别为67.7%(65/96)､62.3%(43/69)､36.0%(18/50),3者比较,差异有统计学意义(χ2=14.203,P<0.05)｡其中SCRLM患者结直肠癌组织中MMP9蛋白的阳性表达率分别与无转移结直肠癌患者的结直肠癌组织和SCRLM患者结直肠癌旁组织比较,差异均有统计学意义(χ2=13.475,13.475,P<0.05);无转移结直肠癌患者的结直肠癌组织中MMP9蛋白的阳性表达率与SCRLM患者结直肠癌旁组织比较,差异无统计学意义(χ2=8.038,P>0.05)｡SCRLM患者结直肠癌组织中Kiss-1蛋白阳性表达率在肿瘤高､中､低分化中分别为66.7%､21.9%､17.6%,在肿瘤浸润肌层､浆膜外､浆膜层SCRLM患者结直肠癌组织中分别为50.0%､28.6%､17.5%,在无和有淋巴结转移SCRLM患者结直肠癌组织中分别为44.0%､16.9%｡不同肿瘤分化程度､肿瘤浸润深度､淋巴结转移情况的SCRLM患者结直肠癌组织中Kiss-1蛋白的表达比较,差异均有统计学意义(χ2=6.546,6.172,7.453,P<0.05)｡MMP9蛋白阳性表达率在肿瘤浸润肌层､浆膜外､浆膜层SCRLM患者结直肠癌组织中分别为25.0%､66.7%､76.2%,在无和有淋巴结转移SCRLM患者结直肠癌组织中分别为44.0%､76.1%｡不同肿瘤浸润深度､淋巴结转移情况的SCRLM患者结直肠癌组织中MMP9蛋白的表达比较,差异均有统计学意义(χ2=12.094,8.690,P<0.05)｡96例患者均获得术后随访｡随访时间为12~176个月,中位随访时间为68个月｡Kiss-1蛋白表达阳性的SCRLM患者中位总体生存时间为31个月,中位无瘤生存时间为26个月,5年累积生存率为69.6%,5年无瘤生存率为26.1%;Kiss-1蛋白表达阴性的SCRLM患者中位总体生存时间为26个月,中位无瘤生存时间为19个月,5年累积生存率为24.7%,5年无瘤生存率为12.3%｡两者总体生存情况和无瘤生存情况比较,差异均有统计学意义(χ2=16.578,14.436,P<0.05)｡MMP9蛋白表达阳性的SCRLM患者中位总体生存时间为31个月,中位无瘤生存时间为19个月,5年累积生存率为24.6%,5年无瘤生存率为12.3%;MMP9蛋白表达阴性的SCRLM患者中位总体生存时间为28个月,中位无瘤生存时间为16个月,5年累积生存率为58.1%,5年无瘤生存率为22.6%｡两者总体生存情况和无瘤生存情况比较,差异均有统计学意义(χ2=14.073,8.532,P<0.05)｡SCRLM患者结直肠癌组织中Kiss-1蛋白表达阳性23例(其中MMP9蛋白表达阳性10例､阴性13例),阴性73例(其中MMP9蛋白表达阳性55例､阴性18例),Kiss-1蛋白和MMP9蛋白表达呈负相关(r= -0.291,P<0.05)｡ 结论 Kiss-1蛋白在SCRLM患者结直肠癌组织中表达降低,MMP9蛋白在SCRLM患者结直肠癌组织中表达升高,这与结直肠癌侵袭､转移､预后密切相关｡两者表达呈负相关,提示两者联合检测有望成为预测SCRLM预后的标志物｡

关  键  词

结直肠肿瘤; 肝转移,同时性; Kiss-1; 基质金属蛋白酶9; 预后

结直肠癌是常见的严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一｡在美国,每年约有143460例结直肠癌患者被确诊,有51690例死亡[1]｡到2020年,亚洲国家结直肠癌死亡人数预计将达到376700例[2]｡结直肠癌患者早期症状较为隐匿,由于肠道血液{MOD}及淋巴回流丰富,肿瘤易通过血液及淋巴等途径发生远处转移,而肝脏是最常见的远处转移部位,故多数患者首次就诊时已发生肝转移,即为同时性结直肠癌肝转移(synchronous colorectal cancer liverme- tastases,SCRLM)｡SCRLM患者处于疾病晚期,并发症较多,预后较差,严重影响人类生命健康｡肿瘤作为一种全身性疾病,发生浸润转移需多种因素共同作用｡目前,Kiss-1基因作为肿瘤转移抑制基因逐渐被重视｡大量研究结果表明:Kiss-1基因的表达与肿瘤的转移呈负相关[3-4]｡MMP9通过降解细胞基质成分改变细胞微环境这一关键步骤使癌细胞沿淋巴管或血管等途径发生浸润和转移,亦与肿瘤发生发展密切相关[5]｡本研究回顾性分析2000年1月至2013年5月第二军医大学附属东方肝胆外科医院收治的96例SCRLM患者和69例无转移结直肠癌患者的临床病理资料,收集患者行手术切除的结直肠组织标本进行研究,检测Kiss-1蛋白和MMP9 蛋白在结直肠组织中的表达,探讨其与SCRLM患者临床病理特征及预后的关系,以及两者表达的相关性｡

1 资料与方法

1.1 标本来源

  采用回顾性病例对照研究方法｡收集96例SCRLM患者手术切除的结直肠癌组织及其中50例癌旁组织(距离阴性切缘≥5cm),其中男59例,女37例;年龄27.0~78.0岁,平均年龄55.6岁｡69例无转移结直肠癌患者手术切除的结直肠癌组织,其中男38例,女31例;年龄19.0~76.0岁,平均年龄53.3岁｡

1.2 纳入标准和排除标准

  纳入标准:(1)行结直肠癌根治术｡(2)经术后病理学检查明确诊断为结直肠腺癌,肝转移灶经病理学检查证实来源于结直肠腺癌｡(3)术前均未行新辅助治疗｡

  排除标准:(1)术前行新辅助治疗｡(2)临床病理资料不完整｡

  本研究通过第二军医大学附属东方肝胆外科医院伦理委员会审批｡患者及家属术前均签署手术知情同意书｡

1.3 主要试剂

  通用型SP免疫组织化学染色试剂盒购自上海优宁维公司,DAB显色试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司,抗体稀释液购自上海威奥生物科技有限公司,胎牛血清白蛋白BSA购自美国Sigma 公司,苏木素染液､乙醇溶液(浓度60%､70%､80%､95%､100%)､***均购自上海国药集团,中性树胶购自上海懿洋仪器有限公司｡兔抗人Kiss-1 多克隆抗体(18375-1-AP)购自上海拜力生物科技有限公司｡兔抗人MMP9单克隆抗体(P14780)购自上海AntibodyRevolution公司｡

1.4 方法

  将收集的标本切成1cm3的小块,以10%福尔马林溶液固定,多浓度梯度乙醇溶液(浓度60%､70%､80%､95%､100%)脱水后***固定,石蜡包埋,4μm厚度连续切片｡***脱蜡,水化,枸橼酸盐缓冲液加热修复抗原10min,过氧化氢消除内源性过氧化物酶活性10min｡按SP免疫组织化学染色试剂盒说明书进行染色,兔抗人Kiss-1多克隆抗体和兔抗人MMP9单克隆抗体均按1∶100进行稀释｡DAB显色,苏木精复染｡中性树脂封片｡用磷酸缓冲盐溶液代替一抗染色作为阴性对照,用已知的阳性切片作为阳性对照｡

1.5 结果判定

  由2名有经验的病理科医师采用双盲法判定｡Kiss-1蛋白和MMP9蛋白表达为细胞质内出现棕色颗粒｡每张切片上选取4个高倍视野,每个视野计数200个肿瘤细胞,计算4个视野的平均阳性细胞百分率｡采用半定量法进行判定:平均阳性细胞百分率为0计0分,1%~25%计1分,26%~50%计2分,51%~75%计3分,>75%计4分｡染色强度: 不染色为0分,浅黄色为1分,棕黄色为2分,棕褐色为3分｡将每张切片平均阳性细胞百分率分值与平均染色强度分值相乘为其染色分数:≤3分阴性, >3分为阳性｡

1.6 分析指标

  纳入分析的临床病理因素包括:患者性别､年龄､肿瘤部位､肿瘤直径､肿瘤分化程度､肿瘤浸润深度､淋巴结转移情况､CEA水平､CA19-9水平､大便隐血试验､乙型病毒性肝炎情况､腹腔积液情况｡

1.7 随访

  采用门诊和电话方式随访患者生存情况,随访时间截至2014年8月｡

1.8 统计学分析

  应用SPSS19.0统计软件进行分析｡计数资料的比较及SCRLM患者结直肠癌组织中Kiss-1蛋白和MMP9蛋白表达与患者临床病理因素的关系采用χ2检验或Fisher确切概率法｡采用Kaplan-Meier 法绘制生存曲线,采用Log-rank检验进行生存分析｡相关性分析采用Pearson等级相关分析｡P<0.05 为差异有统计学意义｡

2 结果

2.1 免疫组织化学染色检测Kiss-1蛋白和MMP9 蛋白表达情况

  Kiss-1蛋白的表达位于组织细胞的细胞质｡SCRLM患者结直肠癌组织中大部分无Kiss-1蛋白表达(图1A),阳性表达率为24.0%(23/96);

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图1 结直肠组织细胞质中Kiss-1蛋白表达情况 免疫组织化学染色 中倍放大 1A:SCRLM患者结直肠癌组织中Kiss-1蛋白无明显著色。

无转移结直肠癌患者的结直肠癌组织中Kiss-1蛋白的阳性反应呈染色均一的棕黄色颗粒(图1B),阳性表达率为43.5%(30/69);

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1B:无转移结直肠癌患者的结直肠癌组织中Kiss-1蛋白的阳性反应呈染色均一的棕黄色颗粒。

SCRLM患者结直肠癌旁组织中Kiss-1蛋白的阳性反应呈染色均一的棕褐色颗粒(图1C),阳性表达率为52.0%(26/50)｡

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1C:SCRLM患者结直肠癌旁组织中Kiss-1蛋白的阳性反应呈染色均一的棕褐色颗粒 SCRLM:同时性结直肠癌肝转移。

3者比较,差异有统计学意义(χ2=14.307,P<0.05)｡其中SCRLM 患者结直肠癌组织中Kiss-1蛋白的阳性表达率分别与无转移结直肠癌患者的结直肠癌组织和SCRLM患者结直肠癌旁组织比较,差异均有统计学意义(χ2= 0.702,11.594,P<0.05);无转移结直肠癌患者的结直肠癌组织与SCRLM 患者结直肠癌旁组织比较,差异无统计学意义(χ2=0.845,P>0.05)｡

  MMP9蛋白的表达位于组织细胞的细胞质｡SCRLM患者结直肠癌组织中MMP9蛋白的阳性反应呈染色均一的棕褐色颗粒(图2A),

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图2 结直肠组织细胞质中MMP9蛋白表达情况免疫组织化学染色 中倍放大 2A:SCRLM患者结直肠癌组织中MMP9蛋白的阳性反应呈染色均一的棕褐色颗粒。

阳性表达率为67.7%(65/96);无转移结直肠癌患者的结直肠癌组织中MMP9蛋白的阳性反应呈染色均一的棕黄色颗粒(图2B),阳性表达率为62.3%(43/69);

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2B:无转移结直肠癌患者的结直肠癌组织中MMP9蛋白的阳性反应呈染色均一的棕黄色颗粒。

SCRLM患者结直肠癌旁组织中大部分无MMP9蛋白表达(图2C),阳性表达率为36.0%(18/50)｡

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2C:SCRLM患者结直肠癌旁组织中MMP9蛋白无明显著色SCRLM:同时性结直肠癌肝转移 MMP9:基质金属蛋白酶9。

3者比较,差异有统计学意义(χ2=14.203,P<0.05)｡

其中SCRLM患者结直肠癌组织中MMP9蛋白的阳性表达率分别与无转移结直肠癌患者的结直肠癌组织和SCRLM患者结直肠癌旁组织比较,差异均有统计学意义(χ2=13.475,13.475,P<0.05);无转移结直肠癌患者的结直肠癌组织中MMP9蛋白的阳性表达率与SCRLM患者结直肠癌旁组织比较,差异无统计学意义(χ2=8.038,P>0.05)｡

2.2 SCRLM患者结直肠癌组织中Kiss-1蛋白和MMP9蛋白表达与患者临床病理因素的关系

  不同肿瘤分化程度､肿瘤浸润深度､淋巴结转移情况的SCRLM患者结直肠癌组织中Kiss-1蛋白的表达比较,差异均有统计学意义(P<0.05);而不同性别､年龄､肿瘤部位､肿瘤直径､CEA水平､CA19-9 水平､大便隐血试验､乙型病毒性肝炎情况､腹腔积液情况的患者比较,差异均无统计学意义(P>0.05)｡

  不同肿瘤浸润深度､淋巴结转移情况的SCRLM 患者结直肠癌组织中MMP9蛋白的表达比较,差异均有统计学意义(P<0.05),而不同性别､年龄､肿瘤部位､肿瘤直径､肿瘤分化程度､CEA水平､CA19-9 水平､大便隐血试验､乙型病毒性肝炎情况､腹腔积液情况的患者比较,差异均无统计学意义(P>0.05)｡见表1

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2.3 SCRLM患者结直肠癌组织中Kiss-1蛋白和MMP9蛋白表达与患者预后的关系

  96例患者获得术后随访｡随访时间为12~ 176个月,中位随访时间为68个月｡

  Kiss-1蛋白表达阳性的SCRLM患者中位总体生存时间为31个月,中位无瘤生存时间为26个月, 5年累积生存率为69.6%,5年无瘤生存率为26.1%; Kiss-1蛋白表达阴性的SCRLM患者中位总体生存时间为26个月,中位无瘤生存时间为19个月,5年累积生存率为24.7%,5年无瘤生存率为12.3%｡两者总体生存情况和无瘤生存情况比较,差异均有统计学意义(χ2=16.578,14.436,P<0.05)｡见图3,4｡

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  MMP9蛋白表达阳性的SCRLM患者中位总体生存时间为31个月,中位无瘤生存时间为19个月, 5年累积生存率为24.6%,5年无瘤生存率为12.3%; MMP9蛋白表达阴性的SCRLM患者中位总体生存时间为28个月,中位无瘤生存时间为16个月,5年累积生存率为58.1%,5年无瘤生存率为22.6%｡两者总体生存情况和无瘤生存情况比较,差异均有统计学意义(χ2=14.073,8.532,P<0.05)｡见图5,6｡

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2.4 SCRLM患者结直肠癌组织中Kiss-1蛋白和MMP9蛋白表达的相关性  

SCRLM患者结直肠癌组织中Kiss-1蛋白和MMP9 蛋白表达呈负相关(r=-0.291,P<0.05)｡见表2｡

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3 讨论

  恶性肿瘤的侵袭､转移是多因素､多步骤参与的复杂结果,包括正常组织的破坏､癌细胞浸润至血管及淋巴系统,定向迁移,再浸润,附着并在周围增殖扩散,最后诱导血管生成,为不断生长的肿瘤提供必需的营养物质等｡转移的级联反应中有任何一个步骤被阻断,均可阻止肿瘤的发生､发展｡肿瘤转移抑制基因在恶性肿瘤浸润和转移中的作用逐渐被研究者重视｡Jaeger等[6]为肿瘤转移抑制基因赋予了新的含义:在不影响原发肿瘤生长的条件下,抑制肿瘤的远处转移｡Kiss-1基因由Lee和Welch[7]首次提出并证实其为肿瘤转移抑制基因｡Kiss-1基因普遍表达于人正常胎盘､脑､心脏､肝脏､胰腺､肾脏､骨骼肌等组织器官,其中在胎盘中表达量最高;对成年个体具有生殖调控能力[8-10]｡大量研究结果表明[11-12]:Kiss-1基因在多数肿瘤中呈缺失性表达; Kiss-1基因不仅能调控肿瘤信号通路传导,还参与调控肿瘤血管生成及肿瘤细胞的黏附､浸润､迁移､凋亡等｡本研究结果显示:Kiss-1蛋白在SCRLM患者结直肠癌旁组织､无转移结直肠癌患者的结直肠癌组织､SCRLM患者结直肠癌组织中表达逐渐减少｡这与上述研究结果一致｡

  在结直肠肿瘤中,癌症相关基因启动子的甲基化使基因转录失活是最常见的导致表观遗传学沉默的一种方法｡最近的一项研究结果显示:Kiss-1 基因的甲基化与肿瘤分化程度､复发､转移､患者无瘤生存及总体生存情况有关;同时Kiss-1基因的甲基化还能预测肿瘤特异性生存率,并与CEA联合共同评估结直肠癌的诊断及预后,甚至其准确度高于CEA[13]｡Canbay等[14]的研究结果显示:结直肠癌患者血浆中Kiss-1表达产物———Kisspeptin-54的水平明显低于健康对照患者,且Kisspeptin-54的水平与结直肠癌患者淋巴结转移呈负相关,可作为结直肠癌患者淋巴结转移的一个***预测指标｡本研究结果显示:SCRLM患者结直肠癌组织中,随肿瘤分化程度降低､浸润程度加深及发生淋巴结转移,Kiss-1 蛋白表达逐渐减少;Kiss-1蛋白阳性表达的SCRLM 患者术后生存情况优于阴性表达患者｡这与上述研究结果一致,提示Kiss-1基因作为肿瘤转移抑制基因,抑制肿瘤细胞侵袭､转移｡

  MMPs是在组织外环境中发现的一种锌离子***蛋白,包含26个具有类似结构的同源酶｡目前MMPs家族已被证实在多种人类恶性肿瘤中过表达,且与肿瘤恶性程度有关[15]｡本研究结果显示: MMP9蛋白在SCRLM患者结直肠癌旁组织､无转移结直肠癌患者的结直肠癌组织､SCRLM患者结直肠癌组织中表达逐渐增多｡这与上述研究结果一致｡MMP9作为MMPs家族的一员,在肿瘤侵袭､转移过程中亦扮演了重要角色[16]｡本研究结果显示:随肿瘤浸润程度加深及发生淋巴结转移,MMP9蛋白表达逐渐增多｡这与上述研究结果一致,提示MMP9 基因作为肿瘤促转移基因,促进肿瘤细胞侵袭､转移｡Li等[17]对2390例结直肠癌患者的Meta分析结果显示:MMP9过表达的患者无进展生存时间及总体生存时间均较短,证实MMP9蛋白水平是预测结直肠癌患者预后的重要因子｡本研究结果显示: MMP9蛋白阳性表达的SCRLM患者术后生存情况差于阴性表达患者｡这与上述研究结果一致｡MMP9在肿瘤中的作用还被广泛应用于体外实验和在体内分析基础上建立的动物模型中,为MMP9在肿瘤侵袭､转移方面的作用提供了大量关联性证据[18-19]｡因此,MMP9基因有望作为一个肿瘤预后标志物应用于临床｡

  本研究进一步分析结果显示:Kiss-1蛋白和MMP9蛋白表达呈负相关,提示Kiss-1与MMP9表达调控方面存在某种负调节或相互抑制的关系｡Yan等[20]在Kiss-1基因转染纤维肉瘤HT1080细胞的研究中发现:Kiss-1基因通过抑制核转录因子κB 向细胞核内的迁移,降低核转录因子κB与MMP9 启动子的结合率,导致MMP9蛋白合成减少;MMP9 对组织基质水解作用减弱,从而抑制肿瘤浸润和转移[21]｡张辉等[22]通过Kiss-1siRNA转染Caki-1细胞联合核转录因子κB抑制剂的实验结果发现: Kiss-1基因通过核转录因子κB调控MMP9的表达｡

  总之,Kiss-1蛋白在SCRLM患者结直肠癌组织中表达降低,MMP9蛋白在SCRLM患者结直肠癌组织中表达升高,这与结直肠癌侵袭､转移､预后密切相关｡两者表达呈负相关,提示两者联合检测有望成为预测SCRLM预后的标志物｡

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