趋化因子受体蛋白CXCR3、CCR5 和CCR3在肝硬化脾功能亢进大鼠脾脏组织中的表达及意义

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黎业娟 吕云福

通信作者：吕云福

本文来源

中华消化外科杂志2016年1月第15卷第1期 75-80页

作者单位

海南省人民医院普通外科

摘      要

目的 检测肝硬化脾功能亢进大鼠脾脏组织中辅助性T细胞1型(Th1型)趋化因子受体蛋白CXCR3、CCR5和辅助性T细胞2型(Th2型)趋化因子受体蛋白CCR3的表达及Th1/Th2淋巴细胞亚群平衡状态。方法 采用实验研究方法。将46只雄性SD纯系大鼠,分为脾功能亢进组(36只)和对照组(10只)。脾功能亢进组大鼠采用40%CCl4花生油溶液灌胃,每周2次,每次3.0mL/kg,15%白酒作为饮用水,共8周制作脾功能亢进大鼠模型。对照组大鼠正常饮食。肉眼观察大鼠形态变化,经HE染色、Masson染色,行肝功能检查及血常规验证肝硬化脾功能亢进模型建立成功后,免疫组织化学染色和Western blot检测两组大鼠脾脏趋化因子受体蛋白CXCR3、CCR5、CCR3的表达。正态分布的计量资料以x±s表示,两组间的比较采用***样本t检验。结果 脾功能亢进组大鼠毛色暗淡并且掉毛严重,食欲不佳,活动量较少,精神萎靡,建模第5周开始,大鼠陆续出现死亡,剩余19只。对照组大鼠毛发色光泽正常,食欲佳, 精神状态良好,对外界**敏感,活动量正常。肝脏病理形态学变化:脾功能亢进组大鼠肝组织内可见纤维增粗紊乱,肝组织的正常结构被破坏,纤维束分割肝小叶,破坏的肝小叶和部分增生的肝细胞团被较粗的纤维分割包绕,假小叶形成,肝细胞排列紊乱,弥漫散在脂肪细胞,异形细胞,细胞核增大,甚至有多核细胞。对照组大鼠肝组织未见上述变化。脾脏病理形态学变化:脾功能亢进组大鼠脾脏略显肿胀,血管内皮增厚明显,血管内皮增生,红髓扩大,大部分白髓消失,中央动脉管壁存在不同程度的增厚以及管壁的纤维化,脾窦扩张。对照组大鼠脾脏组织未见上述变化。肝功能变化:脾功能亢进组大鼠肝功能ALT和AST水平分别为(264±111)U/L、(687±299)U/L,明显高于正常对照组的(27±8)U/L、(124±20)U/L,两组比较,差异有统计学意义(t=5.64,4.98,P<0.05);脾功能亢进组大鼠TP水平为(54±8)g/L,低于对照组的(65±3)g/L,两组比较,差异有统计学意义(t=-3.35,P<0.05)。外周血细胞计数变化:脾功能亢进组大鼠WBC计数为(23.9±5.0)×109/L,高于对照组大鼠的(6.2±2.4)×109/L,两组比较,差异有统计学意义(t=3.50,P<0.05);脾功能亢进组大鼠RBC、PLT计数分别为(6.3±0.7)×1012/L、(418±124)×109/L,低于对照组的(8.0±0.6)×1012/L、(1109±161)×109/L,两组比较,差异有统计学意义(t=-2.28, -4.92,P<0.05)。免疫组织化学染色检测结果:CXCR3、CCR5、CCR3阳性表现为细胞膜和(或)细胞质染成黄色、棕色或棕褐色。脾功能亢进组大鼠CXCR3和CCR5的吸光度A值分别为(81.7±24.4)×10-3、(3.6±1.3)×10-3,高于对照组的(19.2±5.8)×10-3、(1.2±0.4)×10-3,两组比较,差异有统计学意义(t=16.22,9.09,P<0.05);脾功能亢进组CCR3的吸光度A值为(8.8±3.7)×10-3,对照组为(7.9± 2.8)×10-3,两组比较,差异无统计学意义(t=0.87,P>0.05)。脾功能亢进组大鼠CXCR3、CCR5阳性细胞率分别为52%±9%、19%±5%,高于对照组21%±5%、10%±3%,两组比较,差异有统计学意义(t= 17.31,8.21,P<0.05),脾功能亢进组与对照组大鼠CCR3阳性细胞率分别为35%±9%、33%±14%,两组比较,差异无统计学意义(t=0.43,P>0.05)。Westernblot检测结果:脾功能亢进组大鼠CXCR3和CCR5 蛋白的相对表达量分别为2.45±0.85、0.94±0.48,高于对照组的1.31±0.95、0.32±0.26,两组比较,差异有统计学意义(t=2.62,2.91,P<0.05),而脾功能亢进组大鼠CCR3蛋白的相对表达量为0.47±0.27, 低于对照组的0.92±0.67,两组比较,差异有统计学意义(t=-2.18,P<0.05)。结论 CCl4致肝硬化脾功能亢进大鼠脾脏中趋化因子受体蛋白异常表达,提示Th1/Th2淋巴细胞亚群已失衡,可能参与了外周血细胞减少的调控。

关  键  词

肝硬化; 脾功能亢进; 趋化因子受体蛋白; 外周血细胞减少

肝硬化脾功能亢进表现为脾肿大,常常并发一系或多系血细胞减少,脾切除术后,外周血细胞数量显著回升,症状缓解。多年以来,研究其机理主要集中在脾内巨噬细胞的数量、活性及吞噬能力[1-3]。新近的研究结果表明:外周血细胞减少与淋巴细胞亚群失衡介导的免疫紊乱有关[4]。辅助性T细胞(Thelpercells,Th)的两个亚群是Th1、Th2细胞, 1型即Th1细胞与2型即Th2细胞的平衡是机体免疫平衡的重要调节枢纽[5]。这为研究肝硬化脾功能亢进的机制开辟了一条新思路。Th1细胞优势性表达的趋化因子受体蛋白为CXCR3、CCR5,Th2细胞优势性表达的趋化因子受体蛋白为CCR3[6-7]。曹志新等[8]报道肝癌合并肝硬化患者脾脏Th1/Th2 细胞因子表达异常,但肝硬化门静脉高压性脾功能亢进患者脾脏中Th1、Th2细胞是否处于平衡状态,目前尚不明确。本研究将趋化因子受体蛋白CXCR3、CCR5及CCR3分别作为Th1、Th2细胞的标志,探究肝硬化脾功能亢进大鼠脾脏中Th1/Th2淋巴细胞亚群平衡状态,为进一步研究肝硬化并发外周血细胞减少原因提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

SPF级雄性SD纯系大鼠购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司,许可证号:SCXK(湘)2011-0003,SYXK(琼)2012-0013。CCl4(分析纯)购自广东光华科技公司。花生油购自嘉里粮油公司。56% 白酒购自保定前门酿酒厂。DAB染色液(聚合物法)购自北京中杉金桥生物技术有限公司。裂解液与Super-GLECL超敏发光液购自上海诺伦生物公司。PVDF膜购自德国Millipore公司。免疫组织化学染色检测使用CXCR3、CCR5、CCR3兔多克隆抗体, 购自武汉博士德公司。Westernblot检测使用CXCR3、CCR5、CCR3抗体,购自美国SantaCruz公司。HRP-conjugated羊抗兔IgG购自美国Jakeson公司。

1.2 方法

采用实验研究方法。本研究通过我院伦理委员会审批,批号为[2015]56号。

1.2.1 建立肝硬化脾功能亢进动物模型:大鼠购买后按海南省药物安全性评价研究中心实验动物清洁级标准,普通颗粒饲料适应性饲养7d,充足{MOD}食物和自饮水。46只大鼠,体质量160～300g,分为脾功能亢进组(36只)及对照组(10只)。脾功能亢进组大鼠采用40% CCl4花生油溶液灌胃,每周2次, 每次3.0mL/kg,饮用水改用稀释为15%白酒,每日灯光照明12h,共8周制作脾功能亢进大鼠模型。对照组大鼠正常饮食。持续观察大鼠进食、饮水、毛皮、活动情况及体质量变化。在第7周,注射**钠进行麻醉处死1只实验鼠,取大鼠肝右叶、脾组织以进行甲醇固定、包埋,HE染色和Masson染色, 观察肝、脾组织的病理学变化,了解大鼠模型进展。肝硬化脾功能亢进成模的标准为显微镜下可见假小叶的生成及瘀血性脾肿大。第8周,抽眼眶血检测ALT、AST、TP,以及血常规检测是否存在外周血细胞的减少,处死脾功能亢进组和对照组大鼠,切取肝右叶和脾脏标本。

1.2.2 病理学诊断:所有标本首先经过10%的甲醛固定,然后肝、脾组织按脱水、透明、浸蜡、包埋程序处理,4μm连续切片,贴附于对聚赖氨酸处理的载玻片上,进行HE染色和Masson染色,肝硬化脾肿大的诊断由海南省人民医院病理科两位医师复诊。

1.2.3 免疫组织化学染色检测:组织切片常规脱蜡至水化,pH6.0柠檬酸缓冲液高温高压修复,3% H2O2溶液中封闭10min,一抗CXCR3(1∶400)比例稀释37℃孵育1h,二抗(酶标羊抗小鼠/兔IgG聚合物),37℃孵育15min,DAB显色5min,苏木素复染1min,1%盐酸酒精分化数秒,流水冲洗5min,脱水透明,封片。CCR5和CCR3免疫组织化学染色的步骤与CXCR3基本一样,不同的是pH8.0EDTA 缓冲液高温高压修复4min,一抗CCR5,CCR3(1∶50 比例稀释)37℃孵育2h,其他步骤相同。以上实验重复3次。每组染色时均同时以PBS缓冲液替代一抗作为阴性对照。每张片子选取阳性明显的5～ 6个不重叠的高倍镜视野(×400),图片像素1600× 1200,采用Imageproplus6.0专业图像分析系统半定量测定CXCR3、CCR5、CCR3的表达。计算平均吸光度A值(meandensity=IOD×1000 Amax )及阳性细胞率(阳性细胞率=阳性细胞数单细胞数×100%),同一标本3张切片测量取其平均值。

1.2.4 Westernblot检测:每个样本加入30μL组织细胞裂解液,将裂解物移至新的离心管中,直接取10μL样本加入10μL2×SDS-PAGEloadingbuffer, 混匀,100℃加热处理5min,冰上冷却,12000×g 离心5min去除不溶性沉淀。每孔上样量为20μL, 10%SDS-PAGE电泳分离蛋白后,半干电泳转至PVDF膜上,转移条件为30mA60min。Blocking Buffer4℃过夜封闭转印膜,一抗CXCR3、CCR5及CCR3(1∶200)37℃孵育2h,辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶2000)37℃孵育2h。最后超敏发光液进行化学发光检测,经显影定影处理后,凝胶成像系统拍照,并采用的是Gel-ProAnalyzer软件来分析处理,结果以目标蛋白分别与GAPDH 63518asee sferase的比值表示。

1.3 统计学分析

应用SPSS19.0统计软件进行分析。正态分布的计量资料以x±s表示,两组间的比较采用***样本t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肉眼观察

脾功能亢进组大鼠毛色暗淡并且掉毛严重,食欲不佳,活动量较少,精神萎靡,建模第5周开始,大鼠陆续出现死亡,剩余19只。对照组大鼠毛发色光泽正常, 食欲佳,精神状态良好,对外界**敏感,活动量正常。

2.2 肝脏病理形态学变化

脾功能亢进组大鼠肝组织内可见纤维增粗紊乱,肝组织的正常结构被破坏,纤维束分割肝小叶, 破坏的肝小叶和部分增生的肝细胞团被较粗的纤维分割包绕,假小叶形成,肝细胞排列紊乱,弥漫散在脂肪细胞,异形细胞,细胞核增大,甚至有多核细胞。对照组大鼠肝组织未见上述变化。见图1。

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图1 脾功能亢进组与对照组大鼠肝脏病理形态学的比较 1A:脾功能亢进组大鼠肝脏 HE染色 中倍放大;1B:对照组大鼠肝脏 HE 染色 中倍放大;1C:脾功能亢进组大鼠肝脏 Masson染色 中倍放大;1D:对照组大鼠肝脏 Masson染色 中倍放大

2.3 脾脏病理形态学变化

脾功能亢进组大鼠脾脏略显肿胀,血管内皮增厚明显,血管内皮增生,红髓扩大,大部分白髓消失,中央动脉管壁存在不同程度的增厚以及管壁的纤维化,脾窦扩张。对照组大鼠脾脏组织未见上述变化。见图2。

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图2 脾功能亢进组与对照组大鼠脾脏病理形态学的比较 2A:脾功能亢进组大鼠脾脏 HE染色 中倍放大;2B:对照组大鼠脾脏 HE染色 中倍放大;2C:脾功能亢进组大鼠脾脏 Masson染色 中倍放大;2D:对照组大鼠脾脏 Masson染色 中倍放大  注:脾功能亢进组:肝硬化脾功能亢进模型大鼠;对照组:正常饮食大鼠

2.4 肝功能的变化

脾功能亢进组大鼠肝功能ALT和AST水平分别为(264±111)U/L、(687±299)U/L,明显高于正常对照组的(27±8)U/L、(124±20)U/L,两组比较,差异有统计学意义(t=5.64,4.98,P<0.05);脾功能亢进组大鼠TP水平为(54±8)g/L,低于对照组的(65± 3)g/L,两组比较,差异有统计学意义(t=-3.35,P< 0.05)。

2.5 外周血细胞计数的变化

脾功能亢进组大鼠WBC计数为(23.9±5.0)× 109/L,高于对照组大鼠的(6.2±2.4)×109/L,两组比较,差异有统计学意义(t=3.50,P<0.05);脾功能亢进组大鼠RBC、PLT计数分别为(6.3±0.7)× 1012/L和(418±124)×109/L,低于对照组的(8.0±0.6)×1012/L和(1109±161)×109/L,两组比较, 差异有统计学意义(t=-2.28,-4.92,P<0.05)。

2.6 免疫组织化学染色检测结果

CXCR3、CCR5、CCR3阳性表现为细胞膜和(或)细胞质染成黄色、棕色或棕褐色(图3)。

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脾功能亢进组大鼠CXCR3和CCR5的吸光度A值分别为(81.7±24.4)×10-3、(3.6±1.3)×10-3,高于对照组(19.2±5.8)×10-3、(1.2±0.4)×10-3,两组比较,差异有统计学意义(t=16.22,9.09,P<0.05);脾功能亢进组CCR3的吸光度A值为(8.8±3.7)×10-3, 对照组为(7.9±2.8)×10-3,两组比较,差异无统计学意义(t=0.87,P>0.05)。见图3。脾功能亢进组大鼠CXCR3、CCR5阳性细胞率分别为52%± 9%、19%±5%,高于对照组的21%±5%、10%± 3%,两组比较,差异有统计学意义(t=17.31,8.21, P<0.05),脾功能亢进组与对照组大鼠CCR3阳性细胞率分别为35%±9%、33%±14%,两组比较,差异无统计学意义(t=0.43,P>0.05)。

2.7 Westernblot检测结果  脾功能亢进组大鼠CXCR3和CCR5蛋白的相对表达量分别为2.45±0.85、0.94±0.48,高于对照组的1.31±0.95、0.32±0.26,两组比较,差异有统计学意义(t=2.62,2.91,P<0.05);而脾功能亢进组大鼠CCR3蛋白的相对表达量为0.47±0.27,低于对照组0.92±0.67,两组比较,差异有统计学意义(t=-2.18, P<0.05)。见图4。

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3 讨论

CCl4法制备肝硬化动物模型,其诱导的动物模型与人类肝硬化的情况基本一致,在临床实验中得到广泛应用[9-10]。本研究通过CCl4灌胃法,虽然大鼠死亡率较高,但第8周就能形成肝硬化脾功能亢进模型。HE染色及Masson染色可见肝组织内纤维增粗紊乱,肝组织的正常结构被破坏,假小叶形成明显;脾脏红髓扩大,大部分白髓消失。脾功能亢进组大鼠肝功能检查结果提示:肝细胞受损,肝脏合成蛋白减少,肝功能障碍。此外,血常规检测,脾功能亢进组大鼠RBC和PLT计数显著减少,特别是PLT 的减少,基本类似于人类肝硬化门静脉高压脾功能亢进的情况[11-13]。而脾功能亢进组大鼠WBC计数显著增高与炎症反应未消退有关。  

趋化因子受体蛋白是调节Th1/Th2优势性反应的重要因素,参与多种生理及病理过程[14-15]。CXCR3、CCR5特定性表达于Th1细胞类型,而CCR3 主要表达于Th2细胞类型,分别引导Th1和Th2细胞在不同组织环境中迁移,分别诱导Th1、Th2优势性免疫反应,同时也影响Th1和Th2细胞的增殖与分化。CXCR3、CCR5和CCR3在免疫性血小板减少性紫癜脾脏组织中的表达已有研究[16]。但在肝硬化脾功能亢进脾脏组织中的表达情况尚不明确。

本研究通过免疫组织化学染色法对CXCR3、CCR5和CCR3进行蛋白水平的定量检测发现:与对照组大鼠比较,肝硬化脾功能亢进组大鼠脾脏中Th1 型趋化因子受体蛋白CXCR3和CCR5的表达水平及阳性细胞率均升高,Th2型趋化因子受体蛋白CCR3 的表达量及阳性细胞率则无变化。Westernblot检测显示:CXCR3和CCR5的蛋白表达较对照组也明显升高,而CCR3的蛋白表达则减少。对于CCR3两种检测方法不一致可能为免疫组织化学染色检测结果不够精细导致。Th1、Th2细胞的活化与极化受趋化因子受体类型和数量的调控。脾脏中CXCR3、CCR5及CCR3的改变将影响T细胞分布的类型和数量,打破Th1/Th2平衡,诱导Th1或Th2优势性反应。巨大脾脏中CXCR3和CCR5的表达增多,CCR3表达减少,这意味着Th0细胞向Th1细胞分化增多,Th0细胞向Th2细胞分化减少,导致脾脏中聚集大量的Th1细胞,分泌更多IFN-γ、TNF-α、IL-2等造血负调控因子, 从而抑制造血干细胞和(或)祖细胞的增殖与分化或诱导其凋亡,最终导致血细胞生成的减少[17-18]。IFN-γ、TNF-α还可以提高内源性NO水平而抑制巨核细胞(血小板进入血循环之前的细胞)的生长,巨核细胞成熟减少致血小板的生成也减少[19]。IFN-γ可以激活巨噬细胞,使其吞噬活性增强,加强对血细胞的吞噬破坏[20]。此外,Th1型细胞还可以通过激活细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxiclymphocyte,CTLs),IFN-γ 可以增强CTLs的杀伤活性,将巨脾内部分血细胞作为靶细胞,释放穿孔素、成孔蛋白及颗粒酶,导致靶细胞裂解或凋亡[21]。有研究结果表明:病毒性肝炎和原发性胆汁性肝硬化患者肝脏中主要表达的趋化受体是CXCR3及配体CXCL9、CXCL10,且与肝纤维化的严重程度成正相关[22]。纤维组织增生是肝硬化脾肿大的重要特征之一,脾脏纤维化使血细胞机械性破坏增加,这可能是导致外周血细胞减少的原因。

综上,肝硬化巨大脾脏中趋化因子受体蛋白CXCR3、CCR5和CCR3异常表达可能参与了肝硬化脾功能亢进的免疫紊乱机制,以及外周血细胞减少的调控。

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