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[妇科] 基因组测序技术在种植前遗传学筛查的临床应用及成功分娩

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发表于 2015-7-29 17:30 | 显示全部楼层 |阅读模式

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患者37岁。因“婚后自然流产后未孕1年”于2013年4月7日来沈阳东方医疗集团菁华医院就诊。

患者平素月经规律,周期为28-30天,量中等,无痛经。2010年结婚,性生活正常,2010年1月至2012年5月间自然妊娠3次,均在妊娠45-50天无诱因下自然流产,其后未避孕,一直未孕。***后检查子宫输卵管造影示:双侧输卵管积水,9月行腹腔镜下双侧输卵管结扎术。男方**常规大致正常。夫妻双方***要求行辅助生殖技术助孕。临床诊断:继发不孕,双侧输卵管结扎术后,复发性流产。


2013年10月于沈阳东方医疗集团菁华医院行ICSI助孕,长效长方案用药,Gn起始剂量225U,取卵当日签署“经**取卵术”, “卵胞浆内单**显微注射”, “囊胚培养”“胚胎冷冻、解冻及移植”和“染色体数目异常的胚胎植入前遗传学筛查”等知情同意书后行**B超引导下经**卵泡刺破及取卵术。共26个卵泡在100mmHg负压下穿刺抽吸取卵26个。取出的卵冠丘复合体培养4小时后,放入80IU/ml透明质酸酶中20-30秒,配合细玻璃管吹打脱去颗粒细胞,以清楚分辨极体为准,26个卵母细胞中有24个为MII期,2个为GV期。行ICSI操作。次日观察共形成受精卵22个,D5形成8个囊胚,D6天形成5个囊胚,其中8个为优质囊胚(4BB以上),并于形成囊胚当日行滋养层细胞采集术,组织冷冻保存待行PGS。10月25日对6枚胚胎滋养层细胞组织行PGS操作,结果显示2枚胚胎正常,4枚异常。


2014年1月14日患者再次来诊行囊胚移植,将一枚染色体正常的4AA囊胚复苏并移植,之后常规黄体支持,于移植后15天,尿及血检查HCG提示生化妊娠,于胚胎移植后35天B超检查发现宫内一个妊娠囊,其内可见胎芽及胎心。妊娠16周行无创产前筛查结果正常。于2014年9月27日行剖宫产分娩一男活婴,体格发育正常,体重3300g。


材料与方法


(1)滋养外胚层细胞活检:采用二步法,第一步是在活检前段D3对所有的胚胎进行透明带打孔。D5或D6天对形成的8个优质囊胚行滋养层细胞采集术,每个囊胚各采集滋养层细胞5-10个,按冷冻顺序编号,分别为001至008号,冷冻保存,其中001-006号标本行PGS。


(2)全基因组扩增(REPLI-g Single Cell Kit):采用MDA方法,使用QiagenProtocal:Amplification of Genomic DNA from Single Cells试剂盒对001至006号冷冻样本进行全基因组扩增。


(3)全基因组扩增纯化:使用Promega Kit 试剂盒对MDA扩增的产物进行纯化。


(4)全基因组扩增质量控制:对扩增的产物进行检测,确定无污染。


(5)建库:使用Qubit测DNA浓度,用Ion Shear TM Plus试剂盒将长链DNA进行打断,然后进行纯化,使用Ion Plus Fragment Library Kit进行连接,加上接头和标签(Barcode),再纯化,使用E-Gel Size Select收集长度约200bp片段,再进一步扩增,最后再进行纯化。


(6)乳液PCR(One Touch):使用Ion PGMTM Template OT2 200 Kit试剂盒对小片段的DNA进行扩增。


(7)乳液PCR 富集(One Touch ES):对One Touch的产物进行纯化。(8)测序:使用Ion PGMTM Sequencing 200 Kit V2试剂盒,将富集的样本处理后加到芯片后在Ion torrent 半导体基因测序仪(PGM)进行测序。(9)测序结果分析。


结果


001号和004号标本为正常,其余4例均为异常。


讨论分析


胚胎植入前遗传学筛查(preimplantation genetic screening,PGS)是辅助生殖技术与遗传学分析技术相结合的一种植入前诊断技术,广泛应用于胚胎染色体数目异常(非整倍体)的筛查。不同于PGD,PGS主要用于无已知遗传学异常,但存在高度胚胎非整倍体风险的夫妇,以提高体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer,IVF-ET)的着床率和活产率,降低流产率。目前主要使用PGS的患者是高龄女性,还有复发性流产和胚胎反复种植失败的患者。


随着技术的进步,传统FISH和目前采用的芯片技术对染色体异常诊断的覆盖率、分辨率、诊断时间和准确度受到不断考验。DNA测序技术在生物技术领域有着广泛的应用,二代测序技术基于焦磷酸测序的原理,实现了边合成边测序,具有速度快、准确度高、成本低、覆盖度深和数据产出大的特点,为基于单细胞水平的PGD/PGS开辟了新天地,为进行全面的染色体筛查提供了可能。上述这例患者行囊胚滋养层细胞活检,并进行全基因组测序,后选择染色体正常的胚胎移植回患者体内,获得临床妊娠并成功分娩。在卵裂期进行胚胎活检,理论上可能会降低胚胎生长速率,与活检卵裂期胚胎单个卵裂球进行全基因组测序相比,囊胚期活检只取将要发育为胎盘的滋养外胚层细胞,内胚层细胞(发育形成胎儿)不受影响。目前研究认为囊胚期活检和全部染色体非整倍体筛查联合应用可提高IVF妊娠结局,是最佳的PGS策略,但仍需要大规模随机临床对照试验验证PGS疗效和远期影响。

(来源:医学***网 )


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