胰岛分离、纯化和活率、功能检测方法讨论【抛砖引玉】

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大鼠胰岛细胞分离与纯化
1.成年雄性SD大鼠，8～10周龄，体重250～300g，10%**钠40mg/kg肌肉注射麻醉。
2.固定四肢成仰卧位，胸腹部备皮后常规碘酒、酒精消毒，腹部“个”切口，分层进入腹腔，牵开肠管，显露胰管及胆总管。
3.1号丝线于胰管紧靠肠壁处结扎，胆总管内插入4.5-5号头皮针，丝线结扎固定，切开胸腔，破心放血处死，经胆总管内插管逆行注入预冷的0.5mg/ml胶原酶p溶液8～10ml（视个体大小而定），使胰腺膨胀，迅速摘取整个胰腺，移入预置6ml Hank,s液的消化瓶中。
4.38℃水浴中静止消化10分钟，取出置于冰浴中用眼科镊撕碎胰腺，（消化熟练后可免去此步，直接振摇。此步可了解消化的情况，很容易撕碎的表示已达到消化的要求）。移入消化瓶中振荡15秒使其呈细砂状，加入4℃新生牛血清10ml与4℃Hank,s 液30ml终止消化。
5.用不锈钢网（600μm）过滤，细胞悬液用50ml离心管1000 rpm 4℃离心2分钟，弃去上清液，沉淀物加入4℃ Hank,s 液洗涤，同样方法离心洗涤，加冷Hank,s 液重悬后均分到2根15ml离心管内，1000 rpm 4℃离心2分钟，弃去上清液。
6.沉淀物加25%Ficoll 4ml混匀，其上依次分别加入23%、20%、11%Ficoll溶液和Hank,s液各2ml，3000rpm，4℃离心20分钟，吸出23%～20%及20%～11%界面的胰岛，用4℃Hank,s液于50ml离心管内离心洗涤2次备用。

胶原酶P配制：在D-Hank,s液中加入7.5mmol/L CaCl2、10mmol/L HEPES、0.2%酚红指示剂，用NaON调PH值（7.8）后储存。临用时取上述配制好的溶液按0.5mg/ml加入腺原酶P，0.22um针头滤器过滤除菌后使用。

Ficoll400配制：
1、Ficoll 100g+Hank,s溶液200ml，完全溶解后加Hank,s至400ml即为25%Ficoll溶液。
2、25%Ficoll 92ml+Hank,s 8ml 即为23% Ficoll溶液。
3、25%Ficoll 80ml+Hank,s 20ml 即为20% Ficoll溶液。
4、25%Ficoll 44ml+Hank,s 56ml 即为11% Ficoll溶液。