【讨论】 肝脏移植免疫耐受研究进展

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肝脏移植免疫耐受研究进展


目前，排斥反应仍是影响移植器官成活的最大障碍。反复发作的排斥反应造成的积累损伤以及长期应用免疫抑制剂的毒副作用，严重影响移植物的功能和长期存活。尽管如此，肝脏移植仍具备许多不同于其他它器官移植的特点：肝脏移植后急性排斥反应的发生率及严重程度，均明显低于肾移植；HLA不相符也不影响肝移植的成功；肝移植还可保护相同供者的肾移植免遭体液或细胞免疫排斥的攻击。而在动物实验中，肝移植的耐受则更常见，即便供受体MHC完全不同，在所有测试过的小鼠品系之间，许多大鼠品系之间，远交系猪之间以及灵长类动物之间的肝移植，仍可不需应用免疫抑制剂即产生自发性免疫耐受。此外，在大鼠还观察到肝移植可以逆转已发生的相同供体的心脏或胰腺、肾脏移植的排斥反应。一些移植中心的临床试验表明，部分肝功能稳定的肝移植病人甚至可以完全撤除免疫抑制剂。芝加哥大学肝移植中心对17例CsA相关毒副作用的肝移植受体撤除CsA，仅以AZA和小剂量激素维持治疗，随访33－64个月以后，其中13例肝脏功能维持良好，没有出现排斥反应[25]。而日本学者最近的报道更加振奋人心，他们对63例***供肝肝移植受体逐步减量撤除FK50为主的全部免疫抑制剂，其中24例撤药后肝脏功能和移植物保持良好[9]，获得了完全的免疫耐受。总之，无论动物实验还是临床研究都表明，肝脏具有独特的耐受原性。

1．肝移植耐受诱导的主动性

肝移植耐受的形成是一个主动的过程。自发耐受的肝移植动物模型中，并非一开始就出现供受体双方的无反应状态，而是在早期经历一个急性排斥应答阶段[1]。组织学检查证实了个过程的存在。但这个过程并不导致进行性肝损害的发生，而是可以自行恢复。在大鼠MHC不同的品系之间的肝移植早期表现出一个不稳定的阶段，这个过程与供受体之间的免疫应过程有关。如果受体安然度过这个阶段，则可发生耐受，以后能接受相同供者的皮肤移植物并无限期存活。受体的过客细胞（Kupffer细胞、DC等）与受体抗供者淋巴细胞之间的相互作用被认为是导致这个免疫应答过程的主要原因，在这个过程中，要么移植物被排斥杀伤，要么实现双方和平共处[2]。

对细胞因子的检测也证实了早期免疫系统的激活在耐受诱导中的作用。在自发耐受的同种异体肝移植动物模型，移植后第2天汇管区出现明显白细胞浸润，于第7天达到高峰，润的细胞主要是T细胞，也包括B细胞、巨噬细胞、噬酸性粒细胞和中性粒细胞。在浸润的T细胞中，CD8+细胞高于CD4+细胞，且多为CD25+ 的活化T细胞[3,4]。此外，还伴有移植物以及脾脏、淋巴结中IL-2、IFN-γ等基因及蛋白表达的上调。移植后14天，移植物浸润逐渐减弱。而在同系移植中，这些细胞因子的表达不发生改变。
以上现象表明，同种异体肝移植的耐受诱导是一种积极的免疫应答，而急性排斥实际上是这个应答过程的必然结果，此阶段过度的免疫抑制虽可抑制排斥反应发作，但同时也可能对耐受的诱导产生不利影响。一项对肝移植自发耐受大鼠应用甲基强的松龙（MP）的研究发现，术后早期应用MP不仅可以抑制排斥反应，也抑制免疫耐受的产生[5]。一味追求完全抑制术后早期排斥反应的发生，也许并非临床器官移植后免疫抑制的最佳方案。基于此，有人提出，在肝移植的诱导治疗中不用MP,而保留MP在急性排斥发作治疗中的应用。临床资料显示，这种方案并不导致死亡率升高和移植物失功能、排斥反应发作的危险性增加，而移植后的肝功能更好[6]。临床研究也证明，移植后早期的临床或亚临床排斥发作与移植物的远期预后无相关性[7]。 Wiesner等发现，至少有一次急性排斥发作的肝移植病人，日后的肝功能和存活期要优于没有发生急性排斥的受体[8]。也有人提出，应用药物诱导免疫耐受应留出一段“时间窗”以供供受体之间的免疫反应以达到耐受状态。给同种异体猪肾移植静脉给予7天高剂量环孢素，在首次应用环孢素后留出48－72h的间隙，然后用完其余6天剂量，并在移植同时输注供者脾细胞或输血，可以在约50％的受体诱导出耐受[2]。

2．肝移植的分离耐受现象

接受同种异体肝移植后的大鼠虽然可以耐受相同供者的其它器官移植，但在体外实验中，受体脾细胞却能针对供者抗原产生混合白细胞反应和细胞毒性T细胞反应阳性 [10]，这种现象被称为“分离耐受”。这种现象说明，肝移植耐受过程并不导致异基因应答T细胞克隆的缺失，而是通过抑制效应性异基因应答T细胞的增生或存活诱导耐受。分离耐受的机制尚未完全明确，解释之一是，通常只有一小部分高亲和力T细胞参与对移植肝的排斥，而移植后的肝脏可以清除掉这些细胞，剩下的低亲和力抗供者T细胞不能排斥移植物，但仍可以对体外分析试验的**发生反应。另一种解释是，异基因应答T细胞可能有独特的再循环模式，而在肝脏移植过程中发生了改变，在这种情况下，移植的肝脏就可逃避潜在的异基因应答T细胞的攻击。因此异基因应答T细胞能正常存在于肝外部位，但却无法排斥移植肝。

3．可溶性MHCⅠ抗原的作用

研究显示在健康人的血清中存在可溶性MHCⅠ抗原，而肝脏是这些可溶性MHCⅠ抗原的主要来源。在体外实验中，这种可溶性MHCⅠ抗原可以促进对这种抗原特异的T细胞克隆凋亡。肝脏产生的可溶性MHCⅠ抗原诱导异基因应答T细胞凋亡可能是其机制之一。但一些其它的实验似乎并不支持，因为在供体MHCⅠ基因敲除的小鼠肝移植也可诱导出耐受[11]，并且，在极少数小鼠品系之间的心脏和肾脏移植同样可以发生自发耐受。

4．肝脏内细胞群体的免疫特性

肝脏含有大量造血干细胞，肝移植可以重建接受过致死剂量照射的受体的造血系统。这些造血干细胞群可促进肝移植受体嵌合状态的建立而使之不易被排斥。除了肝细胞，肝脏还含大量的非典型白细胞（如树突细胞），后者能诱导异基因应答T细胞的低反应性，延长移植器官的生存期[12]。此外，与外周血循环相比，肝窦内的白细胞群表达凋亡诱导分子和免疫调节因子较多，而免疫**分子的表达较少[13]。

肝细胞似乎也有一定的免疫调节作用。在窦状隙，血中的淋巴细胞可直接与肝实质细胞发生直接接触[14]，这在体内所有的器官中是独一无二的。体外培养的肝细胞能**天然CD8+ T细胞的增殖，但CD8+T细胞很快就停止生长并死亡[15]。推测肝细胞通过一种类似于活化诱导凋亡的机制清除异基因应答CD8+T细胞，从而有利于耐受的产生。
5．微嵌合现象和Starzl的双向移植排斥理论

嵌合是指受体在接受同种异体或异种移植物后，其体内存在着供体细胞，而在移植物内存在受体细胞，这种供受体细胞相互移行、相互存在的现象称为嵌合。微嵌合是在受体体内供者造血干细胞的低水平存在，这些造血干细胞分化形成的供者白细胞谱系可引起有限的移植物抗宿主反应（GVHR），这可部分抵消受体的排斥反应。1992年，Starzl在移植后长达30年的多种器官移植受体体内发现广泛存在低水平供者白细胞嵌合，一组存活超过10年的肝移植受体显示全身多种组织都存在微嵌合。传统的单向移植排斥理论难以解释这种现象。对此，Starzl提出“双向移植排斥理论”，他认为：血管化器官移植复流后，立即发生细胞移动，移植物中的过客细胞进入受体体内分布于全身组织，受者的白细胞也进入移植物，但在强有力的免疫抑制剂的作用下，双方均无法消灭对方而共存；在器官移植早期，宿主免疫系统被激活发生宿主抗移植物反应（HVGR），同样供者的过客细胞也会被受体抗原激活而发
生移植物抗宿主反应（GVHR），在持久的免疫抑制剂干预之下，诱发各种免疫调节机制，如否决机制、抑制细胞、细胞因子类别偏移等，最终达到无反应状态，形成供受体微嵌合状态；微嵌合状态的长期存在可导致受者对供者器官的移植耐受。

微嵌合状态及双向移植排斥理论是耐受形成理论的重大进展。但微嵌合是否有利于同种异体耐受的形成尚有争论。因为并非所有在功能上发生耐受的移植器官都存在微嵌合现象，此外，部分学者认为，微嵌合可能只是一种表面现象，并非造成肝移植耐受的直接原因。Shirwan等在移植前预先注射供者造血干细胞诱导大鼠同种异体心脏移植耐受，用PCR检测供者DNA发现微嵌合非常普遍，但并非长期存活所必需[16]。Ko等则认为，在诱导供者特异低反应性过程中的关键因素是短期的抗原存在而非微嵌合本身[17]。总之，关于微嵌合与肝移植耐受之间的关系，还有待于更多的研究。

6．异基因应答T细胞的凋亡

另一种关于肝脏耐受的假说认为，肝脏是一个杀伤域（killing field）。异基因应答T细胞进入移植肝，被移植物表达的同种异体抗原激活，然后被肝内杀伤机制清除。由于这种活化、募集、破坏导致循环中异基因应答 CTL前体细胞的特异性清除，故对其它CTL前体细胞没有作用，这样，肝移植就轻而易举达到了移植医生所期望的理想状态--特异性耐受。在自发耐受和药物诱导耐受的肝移植大鼠，都观察到移植物浸润T淋巴细胞和脾脏等次级淋巴组织内异基因应答T细胞的凋亡[18]，而在排斥模型这种凋亡明显减弱。因此认为异基因应答T细胞的凋亡是肝移植耐受的重要原因。T淋巴细胞的激活需要双信号，只有抗原的第一信号**，缺乏第二信号，可导致相应的T细胞克隆的无能或凋亡。第二信号主要由抗原呈递细胞（APC）提供。阻断B7-CD28第二信号途径，可以增强肝内T淋巴细胞凋亡并延长肝移植动物的存活期[19]。有证据表明，肝脏存在较多的未成熟白细胞（如DC祖细胞）低表达CD40、B7等第二**信号分子，这可能是肝移植耐受的重要原因[20]。

7．Th1/Th2细胞因子的平衡偏移

Th 细胞根据分泌细胞因子的不同，分为Th1细胞和Th2细胞两个亚群。Th1细胞主要分泌IL-2、IFN-γ；Th2主要分泌IL-4、IL-10。前者主要参与促进细胞免疫应答，后者主要参与促进体液免疫应答，Th1细胞因子抑制Th2细胞，反之亦然。以前的研究发现，在无排斥反应时IL-4水平较高， IFN水平低下；而在发生急性排斥反应时，则出现相反的细胞因子分泌模式。用抗IL-4抗体处理已诱导耐受的小鼠皮肤移植可以打破其耐受[21]。据此曾经认为，Th1细胞因子可能倾向于诱发移植排斥反应，而Th2细胞因子则通过抑制Th1细胞因子诱发免疫耐受。然而，无论在人类还是动物肝移植模型，都缺乏Th1/Th2细胞因子表达和移植预后之间的相关性。虽然研究显示Th2细胞因子可能是长期耐受的移植受体的主要细胞因子谱系[22]，但很少有证据表明这种谱系是导致移植物耐受的原因。用IL-10或IL-4处理即将发生排斥的移植物，并不能将排斥逆转为耐受[23]。有些实验甚至认为Th2类型反应与排斥有关。在大鼠肝移植自发耐受模型早期，未观察到向Th2型细胞因子的免疫应答偏
离。在大鼠肝移植耐受和排斥模型，术后1周内在移植物内Th1和Th2细胞因子mRNA
的表达的量基本类似。由于供者白细胞可迁移进入受体淋巴组织，因此对受体淋巴组织（脾脏、淋巴结）内的细胞因子表达进行检测，发现在排斥和耐受的肝移植受体淋巴组织内淋巴因子表达存在显著不同[24]。在自发耐受的大鼠肝移植受体脾脏和淋巴结内，IL-2和IFN-γ等Th1细胞因子的mRNA表达水平明显高于排斥受体，这与供者白细胞迁移峰值在移植后24小时出现相一致。后来进行供者照射破坏过客白细胞迁移后再行肝移植即发生排斥，Th1细胞因子表达也不增加。有关细胞因子对移植物发生耐受抑或排斥的作用还有待于进一步探讨。

8 小结

自发性肝移植耐受是一个长期的过程，对于这个过程中发生的免疫学事件并不完全了解。目前认为这个过程依赖于移植物内的供者白细胞的迁移。后者迁移进入受体全身的淋巴组织，导致受体抗供者免疫细胞的早期激活，并导致异基因应答T细胞的克隆性清除，这个过程导致了移植后早期轻度排斥反应的出现。尽管目前的研究取得了一定的进展，但临床肝移植耐受的真正实现还期待更多的研究。