氧化磷酸化促进慢性肾脏疾病的血管钙化

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近期，华中科技大学的徐钢教授团队在Cell death & disease杂志上发表了一篇名为Oxidative phosphorylation promotes vascular calcification in chronic kidney disease的文章。该研究通过体外细胞实验和动物模型，深入探索血管平滑肌细胞钙化的葡萄糖需求，检测并验证了氧化磷酸化在血管钙化中的作用，为治疗CKD患者血管钙化提供了新的潜在治疗策略。

研究背景

慢性肾脏病（CKD）人群中的主要血管病理是中膜钙化，而血管平滑肌细胞（VSMC）是动脉中膜的主要成分，是调节中膜钙化进展的主要细胞。葡萄糖被认为是VSMC的主要能量来源，近年来，有研究报道葡萄糖代谢参与了血管钙化的进程。***酸脱氢酶激酶（PDK）是介导葡萄糖代谢从氧化磷酸化（OXPHOS）转变为糖酵解的酶。在啮齿动物模型中，二***盐对PDK 4的抑制消除了维生素D3诱导的钙化。但既往研究中并没有探索葡萄糖代谢在CKD条件下的作用，同时OXPHOS是否参与血管钙化的进展尚不清楚。

研究内容

1、钙化的血管平滑肌细胞和主动脉葡萄糖代谢增强

对高磷酸盐处理的VSMCs进行了转录组学分析。差异表达分析结果显示，与正常对照组相比，高磷酸盐组有867个显著上调的基因和1451个下调的基因（图1A）。KEGG分析显示代谢途径在高磷酸盐组中富集（图1B）。高磷酸盐组的ATP浓度显著高于对照组（图1C）。高磷酸盐组葡萄糖消耗速率显著增加（图1E），并且通过fasentin抑制葡萄糖摄取减弱钙化（图1F）。乳酸盐的浓度，两组之间没有差异（1G）。与饲喂正常磷酸盐饮食的假手术小鼠相比，CKD组的主动脉中的ATP浓度更高（图1 I），而两组之间的乳酸产生没有明显差异（图1J）。

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图1 钙化的血管平滑肌细胞和主动脉中葡萄糖代谢增强


2、在高磷酸盐诱导的钙化VSMC和尿毒症条件下VSMC中OXPHOS增强

对高磷酸盐组进行GSEA富集分析，结果显示OXPHOS显著富集（图2A）。聚类分析显示，OXPHOS相关基因在用高磷酸盐组增加（图2B）。糖酵解相关基因在分化期间保持在相似的水平（图2E）。在高磷酸盐处理的VSMC中，促进***酸流入线粒体中的OXPHOS的基因的表达水平增加（图2F），表明增加的OXPHOS可能由增加的***酸流入线粒体介导。用来自健康参与者和尿毒症患者的血清处理VSMC，结果显示尿毒症血清处理的VSMC中葡萄糖消耗和ATP浓度显著更高，并且在两组之间没有发现乳酸盐产生的差异（图3C-E）。尿毒症血清处理的VSMC显示出更高水平的OXPHOS相关基因和与***酸流入线粒体相关的基因（图3H，I）。

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图2 高磷酸盐诱导的钙化VSMC中OXPHOS增加

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图3 OXPHOS在尿毒症相关钙化中增强


3、2-DG通过上调OXPHOS促进高磷酸盐诱导的钙化

2-DG是主要糖酵解蛋自己糖激酶2的抑制剂，使用2-DG处理VSMC并测量了VSMC中乳酸的产生和OXPHOS相关基因的表达。RT-qPCR结果显示，用2-DG处理后，线粒体呼吸复合物I-IV的表达明显增加（图4A）。用2-DG处理后，高磷酸盐组的乳酸产生显著降低（图4 B）、钙含量和茜素红染色结果显示钙化显著加剧（图4C、D），成骨转化增强（图4 E）。

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图4 2-DG通过上调OXPHOS加速高磷酸盐诱导的钙化

4、细胞色素c氧化酶（COX）参与钙化主动脉和VSMC的OXPHOS增强

对于高磷酸盐组GSEA富集显示COX（又称线粒体复合物IV）被显著富集（图5A）。GO和细胞组分分析中，COX在钙化的VSMC中显著上调（图5B、C）。在CKD小鼠中，COX活性显著高于假手术组（图5D），COX15主要在主动脉的中膜中表达（图5E）。与用对照血清处理的VSMC相比，用尿毒症血清处理的VSMC中COX活性和COX15蛋白水平上调（图5F，G）。高磷酸盐组的COX活性和COX15的蛋白水平显著增加（图5H，I）。

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图5细胞色素c氧化酶参与钙化主动脉和VSMC的OXPHOS增强

5、抑制COX可减弱高磷酸盐诱导的钙化

从小鼠的胸主动脉分离主动脉环，并在存在或不存在ADDA 5盐酸盐（COX的非竞争性特异性抑制剂）的情况下与高磷酸盐一起孵育。结果显示，应用ADDA 5盐酸盐显著降低了主动脉环的钙化（图6A、B）。ADDA 5盐酸盐处理减弱了高磷酸盐诱导的VSMC的钙化（图6C、D）。RT-qPCR证实成骨分化标志物的显著抑制（图6E）。

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图6 抑制细胞色素c氧化酶减弱高磷酸盐诱导的钙化

6、慢性肾脏病患者动脉组织中COX15的表达

为了研究COX15在CKD患者中的作用，对来自中心的34例患者的动脉样本（在动静脉内瘘创建或动静脉移植物放置期间采集）以及因手臂创伤而接受截肢手术且无糖尿病或CKD病史的对照患者（n= 5）的桡动脉样本进行了免疫组织化学。与对照组相比，CKD组中COX15表达的强度显著增加（图7A）。蛋白质印迹的结果证实了COX15在CKD组中的动脉组织中增加（图7B）。根据COX15的表达强度，进一步将CKD患者分为两组。具有强COX15染色的CKD患者的主动脉弓钙化（AAC）评分显著升高（P= 0.035）。比较有和没有AAC的CKD患者之间的COX15染色强度，结果显示有AAC钙化的患者COX15染色水平高于无钙化者。

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图7 CKD患者动脉中Cox15的表达增强

研究结论

研究揭示了钙化的血管平滑肌细胞的一个新的代谢特征，表明在葡萄糖代谢中对氧化磷酸化的倾向。同时，COX15的表达水平与AAC呈正相关，抑制COX可显著降低血管钙化。这些发现为治疗CKD中的血管钙化提供了新的潜在治疗策略。

参考文献

Shi J, Yang Y, Wang YN, Li Q, Xing X, Cheng AY, Zhan XN, Li J, Xu G, He F. Oxidative phosphorylation promotes vascular calcification in chronic kidney disease. Cell Death Dis. 2022 Mar 11;13(3):229. doi: 10.1038/s41419-022-04679-y. PMID: 35277475; PMCID: PMC8917188.

作者： 卢士玖
来源： 江苏省人民医院肾内科  公众号
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