肺炎支原体感染检测的研究进展

深***8

肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae，MP）是引起儿童社区获得性肺炎（community-acquired pneumonia，CAP）的第二大病原菌，可占CAP的20%~40%，在封闭人群中高达70%。自2000年以来，大环内酯类耐药肺炎支原体感染（macrolide-resistant Mycoplasma pneumoniae infections，MRMPI）的比例在世界范围内迅速上升，尤其在东亚地区，如中国MRMPI菌株的占比高达69%~95%，这是引起重症和（或）治病例、并发症和后遗症的重要原因。由于缺乏灵敏、特异、快速的检测方法，肺炎支原体感染（Mycoplasma pneumoniae infections，MPI）的诊断一直是一个具有挑战性的问题。近年来，新的检测方法的不断研发为MPI和MRMPI的早期实验室诊断提供了新的思路。现就MPI尤其是MRMPI的检测方法的研究进展进行简要综述。


一、MPI的检测方法


1.MP培养：MP培养是诊断MPI的金标准，它具有100%的特异度，但由于需要特定培养基，且程序复杂、周期长（至少2周）、灵敏度低，不建议将MP培养作为临床常规检测。

2.MP血清学检测：（1）MP抗体检测：酶联免疫吸附试验是应用较广泛的检测MPI的方法，它通过检测血清中MP-IgM、MP-IgG等抗体提示MPI，但MP-IgM在感染后1周左右检测到，在3~4周后达到高峰，因此感染早期可能存在假阴性的问题，在一定程度上会影响重症和（或）难治病例的早期干预；颗粒凝集法通过检测恢复期和急性期MP抗体滴度呈4倍及以上增高或减低时可以确诊MPI，难以用于急性感染的早期诊断；人类接触病原菌后可以迅速引发循环抗原特异性抗体分泌细胞（antigen-specific antibody-secreting cells，ASC）反应，比抗体反应更快、持续时间更短，一般在疾病症状出现第4天就能在外周血中被检测到，在第6~8天达到峰值，在第14天消失，但具体时间因病原菌有所差异。有研究发现用酶联免疫斑点技术测定MP-IgM-ASC可以区分MPI或携带，且最早在症状出现后2 d就能被检测到，在第12天达到高峰。但目前无法通过灵敏度和特异度来量化酶联免疫斑点技术法诊断MPI的准确性。该方法对临床血样的送检时间（<4 h）和状态（新鲜或冻融）有一定要求，时间过长或冻融血样会导致ASC活性降低，且即使在免疫反应的高峰期，可检测的特异性ASC数量也较小，检测灵敏度较低，尚未投入临床应用。（2）MP抗原检测：MP-IgM免疫胶体金技术靶向MP的P1抗原进行血清学检测，与实时PCR相比特异度和灵敏度分别为100%和97.4%，且无需专业仪器设备，操作简单快速，在早期和快速检测中具有潜在临床价值。但其具有高特异度和高假阴性的特点，可能更适用MPI的初筛、暴发性流行期间对封闭人群的检测以及资源缺乏的情况。


3.MP分子生物学检测：（1）核酸扩增技术（nucleic acid amplification techniques，NAAT）包括DNA扩增和RNA扩增，具有周转时间快、污染可能性低、灵敏度高、特异度高、不受时间和免疫功能限制等优点，已被认为是诊断MPI新的金标准。常用的NAAT包括以下3种，①实时PCR和嵌套PCR。实时PCR是直接检测MP的首选方法，与传统PCR相比污染风险小，且能进行高通量和自动化分析，已在临床上广泛使用。嵌套PCR是先后运用2套引物，将第1轮PCR扩增产物作为第2轮PCR扩增的模板DNA，选择性扩增靶序列，具有高灵敏度，尤其适用于拷贝数较小的肺外标本检测。②多重PCR能同时检测MP和其他呼吸道病原菌，并能在1~3 h得到结果，尤其适合用于急诊室等需要快获取病原菌检测结果的临床场合。有研究发现多重PCR具有98.1%的灵敏度和100%的特异度。由于多重PCR靶向多种病原菌，它对于单个病原菌的检测灵敏度通常会比相应的单重检测方法低。此外，多重PCR通常需要高性能仪器和设备齐全的实验室，仪器成本和测试成本都比单重检测高，并缺乏可更改的灵活性，难以普及到基层医疗单位。③环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一种新型核酸扩增方法，比实时PCR检测特异度和灵敏度更高、成本更低，且对样本杂质的容忍度更高，可以检测鼻咽拭子、痰液和支气管肺泡灌洗液等不同类型的临床样本。与测序相比，LAMP的特异度和灵敏度分别为99%和100%。然而，LAMP的多引物设计会导致假阳性率增加，其对残留污染检出率较高也对实验室封闭反应系统提出了更高的要求，尚不适用于实验室条件相对不足的基层医院。同步扩增和检测（simultaneous amplification and testing，SAT）是一种基于RNA的等温扩增方法，耗时2~3 h，价格低廉，非常适合MP的快速检测，且能通过细菌RNA水平推测细菌的增殖和生存情况，其实验室污染风险和假阳性率也因RNA的检测性质而相应减少。与配对血清抗体转换检测对比，其灵敏度为95.1%，特异度为72.8%。因此，SAT可能是感染初期检测MP的有效的诊断工具。但SAT仍存在难以区分活动性感染与MP携带、无法解释采样点与诊断结论关系等局限性，将SAT与其他方法结合使用仍是提高MP诊断效率的较佳方法。（2）银纳米棒阵列表面增强拉曼散射光谱分析（nanorod array surface-enhanced raman spectroscopy，NA-SERS）通过拉曼散射原理将分子的散射光谱转化为分子振动等方面信息，从而识别分子的非破坏性检测方法。将被检测分子与高度有序的银纳米棒阵列基板结合，两者产生的相互作用会使光谱强度显著增加，这种方法称为NA-SERS。有研究证明NA-SERS能够通过检测MP细胞中特异性蛋白质、氨基酸及核酸区分MP及其P1亚型和其他12种人类共生和致病支原体，且不需要PCR或培养进行扩增，具有快速和灵敏的特性，被认为是下一代支原体检测和分型的方法。然而，NA-SERS技术目前缺乏标准操作流程和庞大的光谱库，且复杂标本的定量测定仍需更多研究以增加其灵敏度和可重复性，尚未投入临床应用。（3）基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱分析法是一种将分离培养出的单一菌落进行脉冲电离后通过质谱仪，将其裂解产物中特异性蛋白的光谱与已知光谱进行比对，从而检测病原菌的方法。它还能通过分析核酸或蛋白质的组成区分MP的P1亚型，在具有质谱仪的条件下可以进行低成本、高通量的快速MP鉴定以及分型检测。然而，质谱仪的初始资金投入大、需要大量培养产物以及需要多次洗涤以去除培养基的干扰因素导致的低灵敏度限制了其在临床上的应用。（4）宏基因组二代测序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）是一种能边合成边测序的高通量测序方法，在DNA**过程中通过记录新添加的碱基所携带的荧光标记来确定DNA序列，检测灵敏度和特异度分别高达97.1%和94.1%，在混合感染的检测上更具优势。然而mNGS对于较大的基因结构变异无法识别，不适于区分等位基因的变异。同时基因测序的高灵敏度、标本污染、样本提取问题以及宿主免疫反应等因素也将导致复杂的检测结果和假阳性率偏高。此外，基因测序耗时长、价格高也是阻碍其在临床广泛应用的原因。


二、MRMPI的检测方法

1.体外药物敏感试验：美国临床与实验室标准委员会2011年颁布了MP体外药敏测定指南，推荐用微量稀释法测定低抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC），从而判定其是否耐药。判断标准MIC值为左氧氟沙星≤1 mg/L、莫西沙星、红霉素及阿奇霉素≤0.5 mg/L，四环素≤2 mg/L评定为敏感；红霉素及阿奇霉素>1 mg/L评定为耐药。然而其检测可能需要数周时间，故对于临床抗菌药物的治疗并无明显帮助。


2.基因测序：（1）Sanger测序是测定23 S核糖体RNA基因中序列多态性的最直接的方法，通过荧光标记每种碱基后在电泳上进行检测，获得可见DNA碱基序列从而检测MP变异。该方法能同时检测MP的多种变异以及MP耐药和敏感准种比例，但对临床应用而言过于繁琐和耗时，缺乏实用性。（2）焦磷酸测序通过检测依次加入不同脱氧核糖核苷酸三磷酸后焦磷酸的浓度获得准确的DNA序列信息。该方法不但能检测MRMPI，也是唯一能够量化临床样本中大环内酯类敏感和耐药准种比例的方法，比Sanger测序更加精确，可在治疗过程中对同一MP患儿进行纵向重复检测来监测耐药的出现及其占比变化，从而对下一步治疗起指导作用。然而，焦磷酸测序的临床应用目前仍较局限，需要焦磷酸测序仪和能够执行高复杂测试的技术人员，且耗时较长。

3.PCR：（1）等位基因特异性实时荧光定量PCR是常见检测单核苷酸多态性的方法，它可以靶向具有耐药性的单核苷酸设计特异性引物，并进行扩增，能对PCR产物进行定量检测，已广泛应用于甲型流感病毒的监测。有研究发现，该方法能确定2063（A2063G）和2064（A2064G）位点的变异，且比嵌套PCR后进行测序更具灵敏性，因其能检测混合样本中低占比的耐药准种，将成为耐药监测和研究耐药机制的工具。但该方法每次只能检测一个***，且无法确定该***的类型，在检测多态性***时准确度也会下降。（2）高分辨率熔解曲线分析是通过检测只与目标DNA结合的荧光染料随熔解温度变化而产生的荧光信号值变化，分析PCR产物有无变异。其能检测23 S核糖体RNA基因结构域V中A2063和A2064位点存在变异的MRMPI菌株，具有100%的灵敏度与100%的特异度，但因无法区分急性感染、感染后核酸的持续存在或无症状携带状态而具有假阳性率较高的缺点。（3）基于猝灭探针PCR（quenching probe PCR，QProbe PCR）将用于与***杂交的寡核苷酸探针用荧光标记后与靶DNA杂交，通过荧光猝灭检测发现靶DNA即***的存在，再通过与熔解曲线分析结合，同时检测23 S核糖体RNA域V中2063和2064位的点变异，整个过程可以在数小时内完成，已被批准作为检测MRMPI的方法。如自动化分子诊断系统GENECUBE，其对变异分型的检测结果与直接测序完全一致，灵敏度和特异度均为100%，但专用设备体积大、价格贵难以被基层医院引入。全自动基因分析仪Smart Gene?系统是新一代利用QProbe PCR的检测系统，体积小、价格低、易被基层医疗机构引入，能同时检测MPI和MRMPI，整个过程耗时不超过50 min。研究发现其对MRMPI的检测结果与测序分析的总匹配率为100%，与实时PCR相比敏感度为97.8%，特异度为93.3%。（4）循环PC R设计针 对含有A2063G或A2064G变异序列的特  异性引物和循环探 针，当循环探 针与 变 异  位点结 合时，RNase H将循环探 针中的R N**段切  割并发出强荧 光，从而识别为MR MP，具有快速、灵敏和特 异 性的特点，但无法检测未知或多个***。（5）限制性 片段长度多态性分析，在特定的限制 性 内切酶识别A2063G或A2064G变 异后进行酶解，产生多个不同长度的D N ** 段，从而识别耐药变异。但因耗时且昂贵，在临床实践中缺乏实用 性而仅用于科学研究。（6）单链构象多态（single strand conformation polymorphism，SS CP）通过对相同长度但序列不同导致不同迁移率的D NA链进行测序可以识别变 异。毛细管电泳法（capillary electrophoresis，CE）能分离仅有单个碱基对差异的单链DNA，并缩短时间。有研究将SS CP和CE与嵌套PC R结合，发现其与DNA测序结果一致，且能区分2063和2064变 异，并发现未知变 异。与限制 性 片 段长度多态性分析或DN A测序方法相比，它耗时短（3.5 h）且具有高灵敏度。然而该方法不如实时PC R简单快速，对于该检测方法的研究也较少。
三、总结与展望

随着科技的发展和技术的进步，不断有新的MPI尤其是MRMPI检测技术应用于实验室诊断。NAAT技术已成为新一代的诊断MPI的金标准，其中实时PCR是目前直接检测MPI的首选方法。对于MRMPI的检测，除基因测序外，上述大多方法均针对2063和2064位点的检测。此外，需明确MRMPI***的检测仅起到筛查作用，并不能完全等同于耐药，也无法明确相应抗菌药物的MIC。因此，临床医生需根据临床实际需求综合分析不同检测方法的利弊，以提高MPI检测的特异度和敏感度，以便更准确地指导临床。
参考文献（略）

作者：邹雨航、 李梦瑶、 张园园、 陈志敏
来源： 中华儿科杂志 公众号
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