研究发现 瘦柄红石蕊的次生代谢产物可抗老年痴呆

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瘦柄红石蕊是石蕊科的一种朽木生地衣，从中可以分离出一种自然界罕见的菲醌化合物biruloquinone，该类化合物为9,10-菲醌类物质，是极其罕见的天然醌类化合物，纯化后呈暗紫色晶体。biruloquinone已被发现具有多种重要的活性，如丙肝肝炎病毒（HCV）蛋白酶抑制剂活性、CD45抑制剂活性等。有研究者通过biruloquinone化合物酶活测试实验，发现其对BACE抑制剂也有较强的活性。

酶活性测定是利用酶能专一而高效地催化化学反应的性质，通过测定酶促反应速度来检知体液等生物样品中某种酶的含量和活性的分析技术。上海美迪西的生物部在体外生物学领域有丰富广泛的经验，通过酶水平测定、细胞水平测定、细胞生物学、生物化学、体外同位素测定、稳定细胞株建立、基因敲除、RNAi和MicroRNA技术等，提供一套完整的生物学服务。

研究biruloquinone化合物对BACE抑制剂的活性的实验材料有：瘦柄红石蕊、β-分泌酶（BACE）抑制剂筛选分析试剂盒、相关化学试剂、旋转蒸发器RE-52AA、Synergy HT多功能微孔板酶标检测仪。

试验方法：

1、Biruloquinone的提取和分离

将地衣型真菌瘦柄红石蕊的菌丝体接种于PDB培养基中（5瓶×300毫升/1000毫升三角瓶），15℃、150转/分避光培养30天（发酵液呈深紫色），将全部1.5L发酵液，用乙酸乙酯等体积萃取24小时。将有机层通过Whatman No.1定性滤纸除去菌丝体。重复两次该过程，并将提取液合并，40℃真空浓缩至500毫升。将浓缩的提取物过硅胶柱（230～400目，3.5×80厘米）纯化，用甲苯-乙酸乙酯-甲酸（90∶20∶2，v/v，4升）洗脱，得到暗紫色组分（980毫升），将该组分集中在真空30℃浓缩，获得110mg biruloquinone固体粗提物。然后将粗提物用***-甲醇重结晶法纯化（1：1，v/v），得到35mg暗紫色的biruloquinone晶体。

2、Biruloquinone的体外BACE抑制实验

样品准备：将biruloquinone配成6.25，12.5，25，50，75，100微克/毫升的质量浓度。BACE酶抑制率的测定：

（1）向背景值检测孔加95微升检测缓冲液和2.5微升 80%乙醇溶液；

（2）向空白对照孔加92.5微升检测缓冲液，2.5微升 80%乙醇和2.5微升 BACE；

（3）向样品检测孔分别加95微升检测缓冲液，2.5微升不同浓度的biruloquinone和2.5微升 BACE；

（4）向所有检测孔加2.5微升酶作用底物（10微米），轻轻震荡混匀，室温孵育40 分；

（5）使用酶标仪以激发光（excitation，ex）340nm-发射光（emission，em）500nm检测荧光强度；

（6）每个检测孔3个重复，根据以下公式计算平均抑制率：

抑制率I（%）=[（A2-A3）/A3-A1]×100%

其中：A1为缓冲液背景值；A2为抑制前酶活性；A3为抑制后剩余酶活性。
　　结果：

Biruloquinone体外BACE抑制活性：本实验采用重组人BACE-1，荧光底物含有一个强荧光7-甲氧基香豆素基团，BACE能切割荧光基团和猝灭基团之间的肽酶活性，使荧光增强。因此可以根据荧光的变化值来判断样品对BACE的抑制活性。从图1可知，biruloquinone对BACE的抑制与浓度正相关，抑制率随浓度增加而迅速提高，对酶活抑制50%的浓度（IC50）为62.3微克/毫升（191微米）。在最大浓度为100微克/毫升时，抑制率达68.36%，由此可知，biruloquinone具有较强的BACE抑制活性。

Biruloquinone具有较强的BACE抑制剂活性，在最大浓度为100微克/毫升时，清除率可达68.36%（IC50=62.3微克/毫升）。由此可见，biruloquinone具有一定的治疗AD的能力，这种特性为将瘦柄红石蕊的次生代谢产物biruloquinone开发成为多靶点的抗AD的天然药物提供科学依据。