Scx(Scleraxis)在肌腱组织工程中的研究进展

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肌腱和韧带是骨与肌肉之间起连接作用的致密结缔组织，临床上肌腱及韧带损伤十分常见，传统的治疗方法易形成瘢痕、再断裂等诸多缺点，修复后的肌腱难以完全恢复原有的功能。组织工程化肌腱的出现为治疗肌腱损伤提供了广阔的前景，因此有必要了解肌腱的发育成熟过程，以构建出与人体相近的组织工程化肌腱。近年来研究发现，Scx在肌腱发育发生的各个时期均有表达，对肌腱发生、分化和再生起了重要的作用，是肌腱及韧带的相对特异性分子标志。

Scx的结构及功能

Scx的结构

Scx是一个含有碱性螺旋－环－螺旋(bHLH)的转录因子，1995年Cserjesi等利用酵母双杂交系统筛查组织特异性蛋白时发现，其中一段cDNA蛋白产物具有bHLH结构，能够与E12形成异源二聚体，最早表达于体节的生骨节区室并因此而命名。小鼠的Scx基因定位于15号染色体上，其mRNA全长1140bp，共编码207个氨基酸，在其羧基末端有一富含脯氨酸的区域，为蛋白激酶A、蛋白激酶C、络氨酸激酶磷酸化位点。Scx与其他bHLH家族蛋白高度同源，如与twist同源性达到61%。人类的Scx含有201个氨基酸，其编码基因位于8号染色体上，与小鼠的Scx基因结构相似。

Scx的功能

Scx的表达部位  Cserjesi等的研究发现，在胚胎发生的过程中，最早能在胚胎的9.5～10.5d检测到Scx的转录，首先表达于体节的生骨节、体壁及肢芽的间充质细胞中，随着发育的进展，高水平表达的Scx开始局限于软骨和结缔组织发生的区域，如肌腱、韧带、膈、支气管软骨等处。提示Scx早期在结缔组织如肌腱等的形成中具有调控作用。

Scx与中胚层的形成  中胚层能够发育成肌腱、骨、脂肪、血管内皮等多种组织。Brown等通过基因敲除技术构建S－/－cx小鼠，在观察其胚胎发育的过程中发现，纯合突变鼠在胚胎第6d(E6d)即停止生长，不能形成原肠胚，并且在此阶段形成的胚胎缺乏中胚层，只有外胚层和内胚层。由此可见Scx影响着中胚层的发育，进一步说也影响了肌腱组织的生成。

Scx与肌腱组织  Scx对肌腱的发生分化起着非常重要的作用。Brown等发现Scx在胚胎第11.5d表达在结缔组织如肌腱韧带的始基中。但Scx并非对所有的肌腱都有相同的影响。Murchison等用基因敲除技术构建Scx缺失的小鼠，发现其可以存活，但背部和四肢爪子活动明显受限，而尾巴则完全不能活动，也就是说传递力学的肌腱及肌肉间的肌腱功能受到不同程度的影响，但是起锚定作用的肌腱和韧带不受影响。并且组织学观察显示Scx缺失的小鼠肌腱基质减少且排列紊乱。

Scott等构建小鼠髌腱损伤模型，qPCR结果显示Scx、Tenomo[根据相关法规进行屏蔽]n表达量均明显上调，而后者则在时间上滞后于前者，说明Scx对Tenomo[根据相关法规进行屏蔽]n具有调控作用。Dyment等研究小鼠的髌腱损伤模型中发现，腱旁组织(主要指腱鞘)正常情况下不表达Scx，肌腱损伤后Scx表达增高，腱旁组织增厚且产生更多细胞外基质填充损伤处，证实了肌腱修复过程中的种子细胞来源于腱旁组织而非肌腱内的纤维母细胞。由此可以看出Scx在胚胎发育早期即开始表达，并对肌腱的成熟过程具有调控作用。

Scx与其他结缔组织

Levay等的研究显示，电子显微镜观察出生后Scx－/－小鼠的瓣膜组织结构无序，胶原排列方向紊乱。刘琼等在试验中发现，Scx在牙周韧带干细胞的表达最强且Scx的表达随培养代次的增加而减弱。贺慧霞等分析了人牙周膜干细胞的表型特点，认为Scx可做为牙周膜干细胞的一个特异性分子，为分离和鉴别牙周膜干细胞提供依据。此外，Scx在睾丸支持细胞中也有表达，并且可以调控该细胞的功能以及促进其分化。由此可见，Scx广泛表达于结缔组织细胞中，是结缔组织的标记物。

组织工程与Scx

细胞因子对Scx表达的调控

Mkx(Mohawk)又称为 (Irxl)，是三氨基酸环three－amino－acidloop(TALE)超家族中非典型的同源异型盒基因，与Scx一样也对肌腱的发育成熟起着非常重要的作用。Liu等通过实验证实，Mkx基因缺失小鼠的肌腱变小且脆弱，Ⅰ型胶原和Tenomo[根据相关法规进行屏蔽]n的表达明显下调。本次实验还证实在胚胎期Mkx基因缺失的小鼠肌腱中Scx表达维持在正常水平，同样胚胎期Scx基因缺失的小鼠肌腱中Mkx的表达不受影响，胚胎期的Scx和Mkx的表达看似互不影响。然而另一项实验发现，出生后8周Mkx敲除的小鼠，Scx的表达呈现升高的趋势。因此，Mkx对Scx的影响有待进一步实验证实。

Lorda－Diez等在鸡胚胎未分化中胚层细胞培养体系中加10ng/mlTGF－β1，结果显示ScxmRNA在培养后1h即开始显著表达，提示TGF－β1对Scx的表达具有正向调控作用。生长分化因子(GDF)又称骨形态发生蛋白(BMP)，属于β转化生长因子(TGF－β)超家族。其中GDF－5、6、7、8等对Scx的表达具有正向调控作用。Park等利用不同浓度的GDF－5大鼠脂肪来源的间充质干细胞进行诱导，RT－PCR结果显示最早在第3d即可检测到Scx的转录，并且在浓度为100ng/ml时效果最好，说明GDF－5对Scx的表达调控具有时间和浓度依赖性。并且本次实验还发现Scx的表达先于Tenomo[根据相关法规进行屏蔽]n，提示GDF－5通过Scx来调控Tenomo[根据相关法规进行屏蔽]n的表达。

Haddad－Weber等研究发现GDF－6和GDF－7均能促进BMSCs与前交叉韧带细胞表达Scx、Teno-mo[根据相关法规进行屏蔽]n和其他细胞外基质。2011年，倪明等取第3代大鼠BMSCs在成肌腱培养液中加入不同浓度GDF－7(0、12.5、25.0、50.0ng/ml)。体外诱导培养2周后，实时荧光定量PCR检测各组Scx，发现GDF－7诱导后的Scx转录和翻译水平均明显上调，并指出浓度为25.0ng/ml时的分化效果最好。

Mendias等在肌抑素(即GDF－8)对肌腱细胞的影响研究中发现，给予1000ng/mlGDF－8**后，Scx与Tenomo[根据相关法规进行屏蔽]n表达均达到2倍以上的增长。相比myostatin+/+小鼠，myostatin－/－小鼠形成的肌腱偏小且易碎裂，纤维原细胞密度下降，Ⅰ型胶原的合成减少。

在肌腱发育过程中并非所有的BMP家族成员均对肌腱具有正向调控作用。Chen等的研究证实，激活BMP2信号途径能够抑制hESC－MSC向肌腱细胞的分化，给予BMP抑制剂noggin后能够促进其向肌腱细胞系分化。过表达Scx后，能够产生跟noggin相同的结果，并且可以抑制BMP2在机械力下产生的成骨分化作用，这一过程是通过BMP－Smad－Runx2信号途径实现的。

机械负载**对Scx表达的影响

廖梅旭等将大鼠BMSCs与小肠粘膜下层(SIS)相复合，观察施加动态应变**能否使BMSCs在体外分化为肌腱细胞(TCs)。ELISA法检测培养后细胞上清液中TCs标志蛋白Scx的含量，实验组为(3.56±0.91)μmol/L，阳性对照组为(14.73±2.30)μmol/L，对照组为(0.23±0.14)μmol/L，三组比较差异均具有统计学意义。电镜下观察实验组，细胞形态及排列发生明显变化，细胞变得更加细长，排列规则，方向均一，与受力方向一致，呈类TCs形态。提示在特定应变条件**下，可在体外诱导Scx表达上调，进而促进BMSCs向TCs方向分化。为测定能够在体外促进肌腱细胞分化的最佳负荷因素，Scott等将间充质干细胞接种于人工生物肌腱中，测试不同机械力负荷下的Scx及Ⅰ型胶原的表达量，结果显示最佳方案是增大10%拉力并在相邻周期中间隔10s，拉伸重复次数越多Scx及Ⅰ型胶原的表达量越高。该研究展示出的生物学机制，为损伤肌腱的修复及重建过程中如何进行恰当的锻炼提供了参考。Chen等的研究发现，在体外培养条件下，过表达Scx及联合恰当的机械负荷能够有效的促进hESC－MSC向肌腱细胞系分化及肌腱细胞的成熟。

基因技术联合Scx在组织工程中的应用

Tenomo[根据相关法规进行屏蔽]n也是肌腱组织的特征性分子标志。Alberton等利用基因转染技术将Scx基因导入人间充质干细胞(hMSC)，得到hMSC－Scx细胞，适当条件下培养后运用qRT－PCR技术检测Tenomo[根据相关法规进行屏蔽]n的表达，在对照组即hMSC－Mock细胞中近乎检测不到，而在hMSC－Scx细胞中Tenomo[根据相关法规进行屏蔽]n增长显著(14倍)。另一肌腱组织特征性基因I型胶原的表达也得到了显著上调。Tan等构建了大鼠的髌腱损伤模型，运用基因转染技术将Scx导入肌腱来源的间充质干细胞(TDSCs)，得到GFP－TDSC－Scx细胞，并和对照组一起植入大鼠髌腱损伤处，分别在第2、4、8周测定Ⅰ型胶原的含量，发现只有在第2周时其表达量才显著高于对照组。组织学和生物力学检测发现只有在肌腱修复的早期，GFP－TDSC－Scx组的结果相比对照组才具有统计学意义。因此，Scx在损伤肌腱修复的早期发挥着非常重要的作用，也与之前的研究中认为Scx是肌腱形成早期表达的特异性分子相吻合。

展望

综上所述，Scx在肌腱发育和成熟的过程中发挥着重要的作用。当前Scx主要用于种子细胞向肌腱样细胞分化表型的鉴定，其在组织工程中的应用处于起始探索阶段。人体内环境是复杂多变的，构建出的组织工程化肌腱应用于人体面临免疫排斥反应等诸多挑战，组织工程化肌腱造福于临床任重而道远。如何有效的应用细胞因子、恰当的基因技术以及合理的机械应力**以便构建出在生物学上与正常肌腱相一致的组织工程化肌腱，是进一步的研究方向。Scx对下游靶基因的作用以及上游对Scx的调控机制目前仍未完全知晓，因此揭示Scx的本质还需更多的研究。

来源：中国矫形外科杂志2015年6月第23卷第12期

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切入点不错，是一篇不错的综述