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[临床药师] 多肽类药物

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发表于 2015-9-25 21:05 | 显示全部楼层 |阅读模式

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氨基酸是蛋白质的基本单位,两个以上的氨基酸缩合形成肽链(polypeptide chain)。蛋白质是机体内最重要的一类生物大分子,目前被广泛地作为药物用于疾病的治疗。但是,蛋白质类药物也有缺点,如分子量大、制备困难、存在抗原性、体内易降解等。令人惊喜的是,人们发现某些分子量较小的多肽同样具有类似蛋白质的活性,且功能更显著。随着对这类生物活性多肽的进一步研究,已为新药的研制和开发提供了一个新的途径。从生物学角度看,多肽和蛋白质的区别只是前者结构小一些,后者结构大一些。在人的生命活动中,蛋白质不断分解变化,蛋白质分解后形成多肽,多肽聚合又形成蛋白质。在人体中,多肽是涉及各种细胞功能的生物活性物质,几乎所有的细胞都能合成多肽,所有细胞又受多肽调节。生命科学之所以将目光投向多肽,原因恰恰在于多肽在人体内担当的这种独特的生理和生化反应的信使角色。
蛋白质和多肽之间在分子量上并无明确的区分,习惯上将胰岛素(51个氨基酸组成,分子量5733)视为多肽和蛋白质的界限。也有人将分子量小于104(或2×104)的氨基酸链称为多肽。目前生物医学在人体中已发现了1000多种具有活性的多肽,仅脑中就存在近40种,它们在生物体内的浓度很低,血液中一般仅有10-12~10-9mol/L,但生理活性很强,在神经、内分泌、生殖、消化、生长等系统中发挥着不可或缺的生理调节作用。人们比较熟悉的有谷胱甘肽(3肽)、催产素(9肽)、加压素(9肽)、脑啡肽(5肽)、β-内啡肽(31肽)、P物质(10肽)等。
作为药用的肽,通常是由几个到二十几个氨基酸组成的比较短的多肽。开发和发展内源性活性物质作为治疗疾病的药物具有重要的实用价值,因为它是最符合人体生物学调节规律的治疗手段,可以避免许多其他类型药物给人体带来的不良反应。目前,全世界已经应用于临床的多肽类药物约有几十种,包括人们熟知的胰岛素、胸腺肽、抗艾滋病新药T20以及肽类激素等。近几年蛋白质/多肽类药物市场的发展速度惊人,年增长率达24%,与增长率仅为9%的总体医药市场相比,该领域令人注目。鉴于多肽生物活性高,一些肽在人的生长发育、细胞分化、大脑活动、肿瘤病变、免疫防御、生殖控制、抗衰防老及分子进化等方面又具有极其特殊的功能,多肽类药物的研发自然成为近年生命科学的一大热门领域。
1. 多肽药物的优势
多肽药物是近年来世界新药研究开发的热点,也是我国生物医药研究的重点方向之一。与传统药物相比,多肽药物具有以下明显的优势:
(1)     活性高,在很低的剂量和浓度下即可表现出显著的高活性;
(2)     分子量小,相对蛋白质而言易于人工化学合成,方便进行结构改造;
(3)     合成效率高。近年来技术的进步使多肽的固相合成变得简单,过程自动化,易于控制;
(4)     副作用小。由于许多多肽药物采用与人同源的序列,加之分子量小,无抗原性,不易引起免疫反应。
2. 常见多肽药物分类
生物技术的发展极大地促进了多肽、蛋白药物的研制开发,目前已有40 种以上重要的治疗药物上市,700多种生物技术药物正进行Ⅰ~Ⅲ期临床试验或接受FDA审评,其中200种以上的药物进入最后的批准阶段(Ⅲ期临床与FDA评估)。?
2.1 根据分泌部位分类
2.1.1 加压素及其衍生物:脑神经垂体素、加压素、鞣酸加压素、去氨精加压素、苯赖加压素、鸟加压素(POR-8)等。
2.1.2 催产素及其衍生物:催产素、去氨基催产素、催产素酒石酸等。
2.1.3 促皮质素及其衍生物:促皮质素、锌促皮质素(ACTH-Zn)、磷锌促皮质素、明胶促皮质素、羧纤促皮质素、丝赖促皮质18肽、 甘精促皮质18肽、锌促皮质24肽、促皮质24肽、25肽、28肽等。
2.1.4 下丘脑-垂体肽激素:促性腺素释放激素、促甲状腺素释放激素、生长激素释放激素(CHRH)、生长激素抑制素(CHIH,l4肽)、 促黑色素细胞抑制激素(MRIH)、促黑色素细胞释放激素(MRH)、催乳素释放激素(PRH)、催乳素抑制激素(PIH)、 促皮质素释放激素(LRH)等。
2.1.5 消化道激素:促胃泌素34肽、17肽、14肽、5肽、4肽,胰泌素27肽、胆囊收缩素39肽、33肽、8肽,抑胃肽、 胃动肽、血管活性肽、胰多肽、P物质、神经降压肽、蛙皮肽14肽、10肽等。
2.1.6 其他激素和活性肽:胸腺素a1(28肽)、胰高血糖素(29肽)、降钙素(32肽)、血管紧张肽Ⅰ(10肽)、Ⅱ(8肽)、Ⅲ(7肽)、脑啡肽、内啡肽、睡眠肽、记忆肽、松果肽、胰蛋白酶抑制剂、舒缓激肽(8肽)、蛙皮降压肽(8肽)等。
2.2 根据功能分类
2.2.1 多肽疫苗
传染性疾病,例如肝炎流感疟疾血吸虫病等,流行很广,危害很大。目前,虽然可用化学药物治疗且疗效较好,但治愈后再感染率很高,在疫区需对再次感染者不停地进行治疗。因此,若要从根本上防止这些传染性疾病,就必须借助于疫苗。虽然灭活或减毒疫苗有一定效果,但仍有引起感染的可能性。因此,对于危险性很大的传染病,如艾滋病等,人们就不敢使用灭活或减毒疫苗,对于这类疾病来说,发展合成多肽疫苗显得尤为重要。
20世纪80年代初,Lerner提出了发展合成多肽疫苗的方法。首先确定天然抗原(如病毒或其亚单位)的氨基酸序列,并寻找抗原决定簇肽段;然后合成抗原肽,并试验其诱导产生抗体的能力,选出具有免疫性和保护性的特异性抗原肽制备疫苗。多肽抗原作为完整病毒的一部分,不具备传染疾病的危险性,并可以大量合成生产,是未来疫苗发展的重要途径之一。
合成多肽疫苗研究的第一步是确定抗原肽,其后的关键是制备出有很好免疫原性,同时又无毒副作用的多肽抗原,并结合使用适当的佐剂,以得到较好的免疫效果。由抗原肽制备的合成多肽抗原主要有3类:(1)抗原肽-载体复合抗原;(2)多抗原肽抗原;(3) 多价合成多肽疫苗抗原。
目前对人类危害极大的两种病毒性疾病艾滋病和丙型肝炎均无理想的疫苗,核酸疫苗和多肽疫苗的研究结果令人鼓舞。1999年美国NIH公布了两种HIV-I病毒多肽疫苗,对人体进行的Ⅰ期临床试验结果,证实两种多肽能**机体产生特异性抗体和特异性细胞免疫,并有较好的安全性。我国清华大学也证实HIV-I膜蛋白内一段多肽有很强的免疫原性。丙肝病毒多肽疫苗也显示有良好的发展前景,国外学者从丙肝病毒(HCV)外膜蛋白E2内筛选出一段多肽,它可**机体产生保护性抗体。其它病毒(如甲肝、麻疹、辛德毕斯病毒等)的多肽疫苗及抗肿瘤,避孕等多肽疫苗的研究也取得了较大进展。例如,美国学者NaZ等从噬菌体肽库内筛选出一个12氨基酸小肽,它能特异性地与人卵子结合,阻止**与卵子的结合,可用于避孕疫苗。
2.2.2 抗肿瘤多肽
肿瘤的发生虽然是多种原因作用的结果,但最终都要涉及癌基因的表达调控。不同的肿瘤产生时所需要的酶等调控因子不同,选择特异性小肽作用于肿瘤发生时所需的调控因子等,封闭其活性位点,可防止肿瘤发生。现在已发现很多肿瘤相关基因及肿瘤生长调控因子,筛选与这些靶点特异结合的多肽,已成为寻找抗癌药物的新热点。美国学者发现了一个短肽(6个氨基酸),它在体内能显著抑制腺癌的生长,包括肺、胃及在大肠腺癌为治疗这一死亡率很高的恶性肿瘤开辟了一条新路。流感病毒血凝素-2氨基端模拟肽能进入肿瘤细胞,激活抗癌基因p53,诱导肿瘤细胞的凋亡。P物质(10肽)的一个衍生物对小细胞肺癌的生长有明显的抑制作用。
与正常细胞相比,肿瘤细胞对多种具有抗菌活性的多肽更敏感,目前对引起这种差别的原因还不完全清楚,初步认为与以下几个因素有关:①由于肿瘤细胞的高代谢引起细胞膜电位的改变;②肿瘤细胞膜外表面含有更高的酸性磷脂;③肿瘤细胞的细胞骨架或胞外基质的变化。目前已经发现cecropin及其类似物,magainin及其类似物,cecropinA-magainin,cecropinA-melittin杂合肽及其类似物都对肿瘤细胞具有选择性杀伤作用。
2.2.3 抗病毒多肽
病毒感染后一般要经历吸附(宿主细胞)、穿入、脱壳、核酸**,转录翻译,包装等多个阶段。阻止任一过程均可防止病毒**。最有效的抗病毒药物应该是作用在病毒吸附及核酸**两个阶段,因此筛选抗病毒药物主要集中在病毒**的这两个阶段。病毒通过与宿主细胞上的特异受体结合吸附细胞,依赖其自身的特异蛋白酶进行蛋白加工及核酸**。因此可从肽库内筛选与宿主细胞受体结合的多肽或能与病毒蛋白酶等活性位点结合的多肽,用于抗病毒的治疗。
多肽药物可以3种不同的机制起到抗病毒的作用。第1种是通过直接与病毒粒子相结合而发挥作用。如α-defensins,modelin-1等对疱疹病毒的作用,polyphemusins对HIV病毒的作用。第2种是抑制病毒的繁殖,如mellitin和cecropin A对HIV病毒的作用。第3种机制是通过模仿病毒的侵染过程而起作用。如蜂毒肽及其类似物的结构与烟草花叶病毒核衣壳与mRNA相互作用的区域具有相似性,通过干扰病毒的组装而对病毒产生作用。
HCV非结构蛋白3区(NS3)是一个与病毒**密切相关的蛋白酶,其活性位点已被确定,并且从肽库内筛选到一个6肽(DDIVPC)能显著抑制该酶活性。同样已从肽库内筛选到能与HIV**必需的逆转录酶结合的小肽,及能与HIV外膜蛋白结合防止病毒进入细胞的小肽。这些小肽部分已进入临床试验。
2.2.4 多肽导向药物
已知很多毒素(如绿脓杆菌外毒素),细胞因子(如白细胞介素系列)等有较强的肿瘤细胞毒性,但在人类长期或大量使用时也可损伤正常细胞。将能和肿瘤细胞特异结合的多肽与这些活性因子进行融合,则可将这些活性因子特异性地集中在肿瘤部位,可大大降低毒素、细胞因子的使用浓度,降低其副作用。比如,在很多肿瘤细胞表面存在表皮生长因子的受体,其数量较正常细胞上的数目高几十倍,甚至上百倍,将毒素或抗肿瘤细胞因子与表皮生长因子融合,可将这些活性因子特异地聚集到肿瘤细胞,国内外已有几家将表皮生长因子与绿脓杆菌外毒素融合表达成功。同从肽库内筛选出能与肿瘤抗原特异结合的小肽,也可用于导向药物,因其分子量小,比鼠源性的单克隆抗体更适合用于导向药物。
2.2.5 细胞因子模拟肽
利用已知细胞因子的受体从肽库内筛选细胞因子模拟肽,近年成为国内外研究的热点。国外已筛选到了人**,人促血小板生成素,人生长激素、人神经生长因子及白细胞介素1等多种生长因子的模拟肽,这些模拟肽的氨基酸序列与其相应的细胞因子的氨基酸序列有所不同,但具有细胞因子的活性,并且具有分子量小的优点。这些细胞因子模拟肽正处于临床前或临床研究阶段。
2.2.5.1 胸腺肽
胸腺五肽(thymopentin, TP5)是目前世界上处方量居第一位的免疫调节剂。TP5是人工合成的五肽,其氨基酸序列和结构与胸腺生成素的第32~36位的氨基酸组成相同,即为TP的主要活性部位,功能与TP相同。动物实验和临床研究证明胸腺五肽对免疫功能低下和自身免疫疾病患者的免疫功能具有重要的调节作用。正是由于胸腺五肽优良的免疫调节功能,使其在非典时期的医药市场上十分抢手。
2.2.5.2干扰素
干扰素是哺乳动物细胞在诱导下产生的一种高活性、多功能的淋巴因子,其相对分子质量为2.0×104。干扰素作用于相应的其他同种生物细胞,并使其获得抗病毒和抗肿瘤等多方面的“免疫力”。它能够抑制病毒在细胞内的增殖,加强巨噬细胞的吞噬作用和对癌细胞的杀伤作用。目前,人们已经利用大肠杆菌系统和酵母系统成功地高效表达了干扰素。已上市的干扰素制剂有13种,其中α-IFN 7种,β-IFN 2种,γ-IFN 4种,取得许多国家的批准,用于临床。
2.2.5.3 白细胞介素
白细胞介素是一类抗肿瘤免疫因子,它能够促进T细胞的生长、增殖和分化,也能够促进B细胞的生长和增殖,并且能够增强杀伤性淋巴细胞的功能,也用于癌症的治疗。白细胞介素包括29个成员,其中白细胞介素-2是含量最高的一种。目前,重组白细胞介素2和白细胞介素3已经上市.
2.2.5.4 集落**因子
集落**因子可以分为两类,即粒细胞集落**因子和粒细胞巨噬细胞集落**因子。这类细胞因子促进体内白细胞的增殖,增强粒细胞的功能,调控造血功能,可用于治疗肿瘤病人化疗后白细胞下降等症状。目前已有产品上市,年产值达数亿美元.
粒细胞集落**因子(商品名惠尔血,粒生素,欣粒生等)能促进粒细胞集落的形成,促进造血干细胞向中性粒细胞增殖、分化。对成熟的中性粒细胞可促进游走、吞噬、产酶、释放活性氧、杀菌能力和对外来异物的黏著作用。还可动员成熟中性粒细胞从骨髓进入外周。能使早期多能造血干细胞进入细胞周期,连日应用可促使骨髓造血干细胞进入外周血。适用于骨髓移植后促进中性粒细胞的升高;肿瘤、白血病化疗后的中性粒细胞减少症;骨髓增生异常综合征、再生障碍性贫血伴发的中性粒细胞减少症;先天性、特发***粒细胞减少症。
重组人粒细胞巨噬细胞集落**因子(商品名吉姆欣)能与粒细胞及单核巨噬细胞系前体细胞表面的特异性受体结合,促进其增殖分化,产生中性粒细胞、嗜酸性粒细胞及单核巨噬细胞。与高浓度红细胞生成因子有协同作用,促进红细胞的活力。并能促进成熟细胞向外周血释放。体外研究表明,本品尚可促进单核-巨噬细胞对肿瘤细胞的裂解作用。能提高机体抗肿瘤和抗感染免疫力。
2.2.5.5 生长激素
人生长激素可用于治疗侏儒症和促进伤口愈合,动物生长激素能够加速家禽生长,增加奶的产量。目前,人和动物的生长激素基因都已经在大肠杆菌中得到成功表达,并已有产品投放市场,年产值达到6.25亿美元,并在医学和畜牧业领域取得了很好的应用效果。
2.2.5.6红细胞生成素
红细胞生成素是一种由肾脏产生的作用于骨髓的造血相关细胞因子。它可以缩短原始红细胞的成熟期,调节骨髓中的造血细胞含量。可用于肾功能不全引起的贫血,放射化疗引起的贫血,以及其他一些罕见的贫血症的治疗。此外,还可用于外科手术前准备自体输血的病人。红细胞生成素是一种糖肽,糖基化对它的功能至关重要,因此不能在大肠杆菌等原核细胞中表达。目前,采用的方法是在培养的哺乳动物细胞中表达,因而成本很高,生产过程比较复杂。尽管如此,它上市后产值仍高达每年12.25亿美元,居多种重组药物之首。
2.2.6 抗菌性活性肽
几乎所有类型的生物在微生物入侵时,其机体都会产生一些物质加以抵御,这些物质中大部分是小分子多肽,即抗菌肽。当昆虫受到外界环境**时产生大量的具有抗菌活性的阳离子多肽,已筛选出百余种抗菌肽。抗菌肽一般由12~45个氨基酸构成,来自不同物种的抗菌肽一级结构有相似之处,如含精氨酸、赖氨酸、组氨酸等碱性氨基酸而带有正电,呈疏水性或双亲性。抗菌肽因其结构和作用方式不同可分成两大类:一类是具有螺旋结构的线性多肽;另一类是由一个或多个二硫键或硫醚连接构成的环形多肽,含有β-折叠和(或)α-螺旋。由于其独特的结构,抗菌肽具有分子量小、热稳定、水溶性好、免疫原性较低、作用迅速、抗菌谱广等特点,不仅可以抑杀细菌、真菌、病毒和寄生虫,对多种癌细胞、转化细胞和实体瘤也有明显的抑制作用,且某些抗菌肽在发挥以上作用时对正常细胞没有破坏作用。目前,传统的抗生素大多出现了与其相应的耐药致病菌株,常用的抗癌药物又对“敌我”细胞不能区分,而抗菌肽不受已产生的耐药性突变影响,靶菌株也不易出现耐药性突变,另外其独特的选择毒性作用和其较低的免疫原性引起人们广泛的兴趣,使其成为新一代的抗菌、抗癌药物。
cecropins、magainins、defensins等许多可形成双亲螺旋结构的多肽抗生素是通过作用于细菌的细胞膜,在膜上形成离子通道,引起胞内物质的外漏而杀死细菌的。通过对sarcotoxin IA的研究发现,当在脂质体中存在胆固醇时,sarcotoxin IA对其的裂解作用减弱。这可部分解释这类多肽对真核细胞不起作用的原因。apidaecins类多肽抗生素对细菌的作用机制是非裂解机制,可能是通过与膜上的手性分子相互作用进而杀死细菌的。
许多多肽抗生素除了具有抗细菌的活性外,还具有抗真菌的作用。如来源于蛙类的PGQ,dermaseptin和哺乳动物的defensins对一些人类致病真菌具有杀伤作用,其中兔defensinNP-1对玉米的致病真菌也有作用。一些来源于植物的多肽抗生素,如植物defensins、thionins等对多种植物致病真菌具有杀伤作用。最近,Cavallarin等发现cecropin衍生物N末端α螺旋区域的11个氨基酸顺序与抗真菌活力有关。
2.2.7 用于心血管疾病的多肽
很多植物中药有降血压、降血脂、溶血栓等作用,不仅可用作药物,亦可用作保健食品。但由于其作用成份不能确定。其应用受到很大限制。现已发现很多有效成分是小分子多肽,比如我国科学家从大豆内加工分离出的小分子活性多肽(MW<1000),可通过小肠直接吸收,能防止血栓,高血压高血脂,还能延缓衰老,提高肌体抗肿瘤能力。来源于α-和γ-玉米醇溶蛋白的玉米多肽(Leu-Gln-Gln、Val-Ser-Pro、Leu-Gln-Pro、Leu-Ala-Tyr和Val-Ala-Tyr);来源于无花果乳液的肽类Ala-Val-Asp-Pro-Ile-Arg,Leu-Tyr-Pro-Val-Lys和Leu-Val-Arg均有抗高血压作用;从人参、茶叶、银杏叶等植物内也分离出很多用于心血管疾病的小肽。??
2.2.8 其它药用小肽
小肽药物除在上述几大方面已取得较大进展外,在其它很多领域也取得一些进展。比如stiernberg等发现一个合成肽(TP508)肽能促进伤口血管的再生,加速皮肤深度伤口的愈合。Pfister等发现一个小肽(RTR)4能防止碱损伤角膜内炎症细胞的浸润,抑制炎症反应。Carron等证实其筛选的2个合成肽能抑制破骨细胞对骨质的重吸收。
内**肽-1是国内学者研究较深入的另一个具有开发前景的镇痛多肽。具有强烈镇痛活性,其活性高于**。它存在于哺乳动物脑内,是内源性的μ**受体的激动剂。内**肽-1是迄今所知对μ**受体亲和力和选择性最高的生物活性肽。由于它只含有4个氨基酸,国内学者采用液相合成方法,方便快速、纯度高,且能大量合成。
2.2.9 诊断用多肽
??多肽在诊断试剂中最主要的用途是用作抗原检测病毒、细胞、支原体、螺旋体等微生物和囊虫、锥虫等寄生虫的抗体,多肽抗原比天然微生物或寄生虫蛋白抗原的特异性强,且易于制备,因此装配的检测试剂,其检测抗体的假阴性率和本底反应都很低,易于临床应用。现在用多肽抗原装配的抗体检测系统有针对甲、乙、丙、庚型肝炎病毒、艾滋病病毒、人巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、风疹病毒、梅毒螺旋体、囊虫、锥虫、莱姆病及类风湿的试剂盒。使用的多肽抗原大部分是从相应致病体的天然蛋白内分析筛选获得,有些是从肽库内筛选的全新小肽。
2.2.10 食品感官肽
阿斯巴甜(Aspartame)作为一种非糖甜味剂是一类开发较成功的食品感官肽。阿斯巴甜由苯丙氨酸与天冬氨酸为原料合成,其甜度为蔗糖的200倍,可供糖尿病患者等忌糖者食用,且热量低,可用作减肥保健品。赖氨酸二肽(如N-Ac-Phe-Lys)被证明是有效的阿斯巴甜替代品,因为它不含有酯的功能特性,因而在食品加工和储存过程中更加稳定。我国人口众多,食品消费量数值惊人,甜味剂需求潜力很大。
其它食品感官肽还有苦味肽、酸味肽、咸味肽、增强风味肽、苦味掩盖肽、抗氧化肽、表面活性肽等。这些食品感官肽能够模拟、掩盖和增进口感。如咸味肽作为无钠调味剂,可为糖尿病患者和高血压患者所用,也可作为保健食品。而风味肽则可作为加工食品的风昧和香味的前体,起到增强风味的作用。表面活性肽则可作为食品的稳定剂和乳化剂。食品感官肽在我国生产和应用刚刚起步,但市场潜力巨大,值得进一步研究与开发。
3.多肽药物的稳定性问题及其对策:
多肽因子、蛋白药物主要通过降解、排泄、以及受体介导的内吞等作用在体内被清除。其中分子量小于20kDa的多肽因子在代谢过程中易由肾小球滤过;通过肾小管时多肽因子又被其中的蛋白酶部分降解并从尿中排出,因而半衰期短。为维持一定的疗效需要大剂量反复用药,长期的频繁注射不仅增加了病人的痛苦而且易引发一系列副反应。近几年各国学者主要从化学修饰、基因融合、点突变以及制剂改造等方面着手进行长效多肽药物的研究。
3.1 引起多肽不稳定的原因
3.1.1         脱酰胺反应:在脱酰反应中,Asn/Gln 残基水解形成Asp/Glu。非酶催化的脱酰胺反应与环境条件和多肽结构有关,提高pH值、升高温度都有利于脱酰胺反应的进行。在Asn-Gly-结构中的酰胺基团更易水解,位于分子表面的酰胺基团也比分子内部的酰胺基团易水解。
3.1.2      氧化:多肽溶液易氧化的主要原因有两种,一是溶液中有过氧化物的污染,二是多肽的自发氧化。在所有的氨基酸残基中,Met、Cys和His、Trp、Tyr等最易氧化。氧分压、温度和缓冲溶液对氧化也都有影响。
3.1.3      水解:多肽中的肽键易水解断裂。由Asp参与形成的肽键比其它肽键更易断裂,尤其是Asp-Pro和Asp-Gly肽键。
3.1.4      形成错误的二硫键:二硫键之间或二硫键与巯基之间发生交换可形成错误的二硫键,导致三级结构改变和活性丧失。
3.1.5      消旋:除Gly外,所有氨基酸残基的α碳原子都是手性的,易在碱催化下发生消旋反应。其中Asp残基最易发生消旋反应。
3.1.6      β-消除:β-消除是指氨基酸残基中β碳原子上基团的消除。Cys、Ser、Thr、Phe、Tyr等残基都可通过β-消除降解。在碱性PH下易发生β-消除,温度和金属离子对其也有影响。
3.1.7      变性、吸附、聚集或沉淀:变性一般都与三级结构以及二级结构的破坏有关。在变性状态,多肽往往更易发生化学反应,活性难以恢复。在多肽变性过程中,首先形成中间体。通常中间体的溶解度低,易于聚集,形成聚集体,进而形成肉眼可见的沉淀。蛋白质的表面吸附是其贮存、使用过程中遇到的另一个令人头痛的问题,如riL-2在进行曲灌注时会吸附在管道表面,造成活性损失。
3.2 增加多肽药物稳定性的方法
3.2.1 改进多肽的自身结构:
3.2.1.1 定点突变 通过基因工程手段替换引起多肽不稳定的残基或引入能增加多肽稳定性的残基,可提高多肽的稳定性。
利用寡核苷酸引物、PCR介导的定点突变及盒式突变等方法使蛋白药物中影响活性或稳定性的氨基酸发生突变可以有效提高蛋白稳定性,增加药物半衰期。例如白介素-2是一条133个氨基酸组成的多肽链,其中呈游离状态的Cys-125易形成错误的二硫键配对或形成分子之间的二聚体影响活性和稳定性,将Cys-125用Ser或Ala取代后生物活性比正常高1倍,体内半衰期由数分钟提高到1.2h。重组组织型纤溶酶源激活剂(rtPA)能高效特异地溶解血栓,目前两种新型tPA(K2-tPA、TNK-tPA)已被欧洲和美国批准上市。K2-tPA保留了tPA1-3及176~527位氨基酸的肽段,缺失K1区、E区和F区使之成为单链多肽,无糖基侧链,半衰期延长4~5倍;TNK-tPA突变体是将tPA 103位Thr变成Asn;117位Asn变成Gln;Lys296-His297-Arg298-Arg299替换成4个Ala,该突变体血清清除速率降低4倍左右,已获得美国FDA批准进入市场。自然界中亦存在天然突变体,使其具有更高的生物学活性和更长的血浆半衰期,如载脂蛋白AI(apoAI)的米兰突变体(AIM),即apoAI的Arg173突变为Cys173,两个AIM单体通过Cys173之间的二硫键形成同源二聚体,血浆半衰期得到进一步延长。
3.2.1.2 化学修饰 选择合适的修饰方法和控制修饰程度可提高多肽的生物活性,提高热稳定性,抵抗蛋白酶的降解,降低抗原性,延长体内半衰期。
化学修饰是延长蛋白药物半衰期的一个有效途径,其中应用最为广泛的修饰剂是单甲氧基聚乙烯二醇(methoxypoly ethylene glycol,mPEG),其次是多糖类如葡聚糖、聚蔗糖、淀粉等;同源蛋白质、人工合成多肽类如白蛋白、聚丙氨酸等;长链脂肪酸类以及聚烯属烃基化合物、聚酸酐等。PEG是惰性、两亲、不带电荷的柔性聚合物,分子量随聚合程度而变化(1~50kDa),有线性和支链两种构型,其中线性单甲氧基聚乙烯醇(mPEG)已经FDA批准作为许多药物的安全载体。mPEG通过共价键与蛋白质连接,对蛋白表面氨基进行修饰以有效地改变多肽、蛋白药物在体内的分布和药物学特性。目前mPEG修饰已应用于40多种不同蛋白的修饰如猪血清白蛋白(BSA)、粒细胞集落**因子(G-CSF)、白介素-2(IL-2)等。PEG修饰后血浆半衰期一般可延长几倍至几十倍甚至是上百倍,但大部分蛋白的免疫原性也有所降低,而蛋白的生物活性也有不同程度降低。这可能是由于PEG大分子在蛋白分子周围形成一层外壳阻碍了免疫细胞与蛋白的接触保护了蛋白,掩盖了蛋白酶识别位点避免蛋白酶降解的发生,但同时也使蛋白的活性位点受到影响。中国药科大学田泓等用聚乙二醇修饰干扰素α2的研究表明活性损失与修饰率有关,修饰率保持在30%以内时生物活性保持较好。Yamasaki等在PEG修饰重组人粒细胞集落**因子(rhG-CSF)中发现修饰位点的多少(即1分子rhG-CSF与几分子PEG结合)对半衰期的延长方面并无多大影响,但修饰位点少活性损失就相对少一些;为保持蛋白的生物活性,采取位点特异性修饰即将蛋白功能结构域中易于PEG结合的氨基酸残基换成功能相似不干扰蛋白与PEG结合的氨基酸残基如赖氨酸替换成精氨酸。PEG修饰应用十分广泛,它对酶、多肽、受体、抗体片断等均能实现偶联以延长半衰期,抗体药物是继疫苗之后的第二大生物技术药物产业,但是异体抗体容易产生免疫识别而被清除,经PEG修饰后就可得到明显改善,从而为抗体更广泛地应用于疾病的治疗提供了基础。随着研究的不断深入,不少PEG修饰蛋白药物已经上市或者进入临床。另外,掩蔽多肽分子的末端羧基或/和氨基基团,也可以对抗外肽酶,减少水解作用。
多糖和白蛋白作为化学修饰剂也有成功范例:用于治疗血栓的葡聚糖-链激酶已在俄罗斯上市;白蛋白已作为多种蛋白药物的载体,白蛋白-SOD半衰期由5min提高到6h;白蛋白-GH半衰期由5min提高2~3h,将rhG-CSF通过异双功能试剂聚乙二醇与白蛋白共价偶联,使G-CSF的体内清除速度降低约6倍。也有将蛋白药物与抗体偶联来延长药物半衰期的报道。但是化学修饰是完全随机的,带来的产物不均一性及药物活性的降低似乎是不可避免的,为此有人提出采用酶法进行位点特异性修饰。对于修饰剂的活化方法、修饰位点、修饰率、修饰反应时间等都需要深入研究。
3.2.1.3 基因融合
通过基因融合技术增加多肽和蛋白药物分子量或改变与受体的亲和性等原理延长药物半衰期。人血清白蛋白(HSA)是现有天然载体蛋白之一,并且是血液中含量最高的单一蛋白(达40g/L),是人体血浆的主要成分,在体内有维持血液渗透压,运输营养和其它重要生物物质的作用,具有无免疫原性,人体相容性好,分子量大(约为66kDa),半衰期长(达两周)等稳定剂和多肽运载蛋白的必需性质,它已成功地在哺乳动物细胞和酵母中实现高效表达。日本Green Cross公司酵母表达的HSA 已完成Ⅲ期临床实验和规模化生产的准备,临床实验证明酵母表达的HSA与天然的HSA在效果和安全性方面完全一致。1990年英国delta公司首先将白蛋白用于基因融合提高多肽、蛋白药物的半衰期,1997年申请了HSA与人生长激素(HGS) 的融合蛋白的专利。美国Yeh 等将CD4 与HSA 融合表达,HAS-CD4 融合蛋白在小鼠体,内半衰期较CD4 延长140 倍,使其半衰期与HSA 相似。2001 年美国HGS 公司研制的HSA 与α2干扰素、人生长激素、IL-2的融合蛋白分别进入临床试验,其中人生长激素临床前数据表明其体内清除速率较融合前降低了50倍。用于治疗血小板凝集的73个氨基酸的毒液肽Barbourin 与白蛋白融合后清除率较Barbourin 明显降低且活性保持较好,***融合白蛋白后不仅延长了药效,且增强了其生物学活性。
利用抗体Fc段所特有的生物学功能与某些多肽或蛋白融合可增加该蛋白的血浆半衰期,一般采用引入重链稳定区(Cγ2或Cγ4)构建融合蛋白,例如IL-10是一种抗炎症因子,制备重组IL-10/IgG-Fc融合蛋白能明显延长IL-10的半衰期。Chamow等制备了CD4/IgG,包括CD4的V1,V2结构域,人Ig重链铰链区及Fc段,已进入Ⅰ期临床试验。酵母表达的抗体单链Fv段(scFv)与抗体Fc(人IgG1片断)融合蛋白以二聚体形式在培养上清中,scFv段分子量由原来的25kDa增至106kDa,小鼠体内试验表明血浆半衰期由3.5h延长至93h。据报道scFv片断具有抗蛋白酶降解的作用,与L2天冬酰胺酶融合后L2天冬酰胺酶半衰期由2h延长至9h。IL-2,GM-CSF,TNF,CD4,TNFR 等与抗体片断融合后半衰期都有不同程度的增加,其中TNFR与IgG1(Cγ1)融合蛋白已经美国和欧洲批准上市。
除了利用蛋白载体基因融合外有些细胞因子之间融合也可以实现药效的延长,促血小板生成素(Tpo)富糖基化的C端在体内可能有稳定分子、延长半衰期以提高分子效率的作用,汪治清等构建了红细胞生成素(Epo)-Tpo融合蛋白,初步试验结果显示Epo半衰期由8h增至12h。用基因工程方法生产增强其生物活性的红细胞生长因子二联体/三联体融合蛋白,不仅延长了蛋白体内半衰期而且增强了生物功效,减少用药次数,有望提高红细胞**因子的临床实用价值。融合蛋白基因稳定性高,可调控表达且制备简单,产物均一,对蛋白、多肽药物活性影响小等,是目前研究长效多肽、蛋白药物的良好途径。
3.2.2 添加剂
通过加入添加剂,如糖类、多元醇、明胶、氨基酸和某些盐类,可以提高多肽的稳定性。糖和多元醇在低浓度下迫使更多的水分子围绕在蛋白质周围,因而提高了多肽的稳定性。在冻干过程中,上述物质还可以取代水而与多肽形成氢键来稳定多肽的天然构象,而且还可以提高冻干制品的玻璃化温度。此外表面活性剂如SDS、Tween、Pluronic,能防止多肽表面吸附、聚集和沉淀。
3.2.3 冻干
多肽发生的一系列化学反应如脱酰胺、β-消除、水解等都需要水参与,水还可以作为其它反应剂的流动相。另外,水含量降低可使多肽的变性温度升高。因此,冻干可提高多肽的稳定性。

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