Notch通路在骨肉瘤发病机制中的研究现状

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骨肉瘤(OS)是临床上最常见的恶性骨肿瘤之一，约占原发恶性骨肿瘤的20%，患者多为青少年，恶性程度高，早期容易发生转移，预后欠佳。现阶段多以外科手术治疗为主，辅以化疗等多种治疗措施。随着分子生物学靶向治疗的研究及新辅助化疗的应用，Notch基因信号通路在骨肉瘤的发生、发展中起着重要作用，成为骨肉瘤基因治疗的新靶点，最终从分子水平上控制肿瘤的转移。

Notch信号通路概述

Notch通路的基本构成

Notch基因最早发现于果蝇中，因其缺失部分功能导致果蝇翅膀的边缘形成切迹而得名。自Notch基因被认知，研究人员对其结构和功能进行了一系列研究。Notch信号通路主要包括三部分，分别为Notch受体、Notch配体和DNA结合蛋白。截至今日在哺乳动物中已发现有4种Notch受体(Notchl－4)和5种Notch配体(Delta－like－1、Delta－like－3、Delta－like－4、Jagged1和Jagged2)。Notch受体是相对分子量为30000kD左右的单链跨膜蛋白，由胞外亚基和跨膜亚基构成异二聚体，其表达的保守性较高。胞外亚基包含3个家族特异性的LNR重复序列和串联排列的EGFR(缩写)序列。EGFR在Notch配体与受体的结合过程中起关键性作用。

LNR(缩写)位于EGFR(缩写)的下游，介导着两亚基间的相互作用。跨膜亚基包括跨膜区、2个核定位序列、6个锚蛋白重复序列(ANK)(缩写)、1个多聚谷氨酰胺序列、1个RAM(缩写)序列以及1个PEST(缩写)结构域。Notch信号效应分子CBF1/RBPJk结合的主要部位在RAM结构域。ANK具有模体特性，对Notch通路起修饰作用。PEST结构域能够调节Notch胞内段蛋白的更新。Notch配体与受体同样为单链跨膜蛋白，其胞外含有N端DSL结构域及不等的表皮生长因子样重复序列。Notch配体的胞内域较短，功能尚未明确，有人推测其可能与受体胞内段有相似的地方，有信号转导的作用。果蝇Notch配体有2个同源物Serrate和Delta，Serrate样配体中含有一个富含半胱氨酸的组成部分，而Delta样配体却无这样的区域。

Notch通路的激活与调控机制

自1993年Lieber和Struhl等提出Notch通路激活的“蛋白水解模式学说”以来，该学说不断得到补充和完善，目前Notch三步裂解法得到众多学者的一致认可。第1个裂解位点是在Notch跨膜区胞外端的S1位点，在furin样转化酶的作用下，Notch于S1位点发生裂解，酶切形成的胞外区(ECN)和跨膜片段(NTM)通过Ca2+依赖的非共价键相互结合，以异二聚体形式形成Notch受体，移行于细胞表面。其与配体结合后，Notch受体在金属蛋白酶中的肿瘤坏死因子α转换酶的作用下，在S2酶切位点进行第2次酶切，裂解为2个片段，N端裂解产物被配体表达细胞吞噬，而C端裂解产物在S3位点进一步裂变。

经过蛋白酶presenilin水解酶切后转化为可溶性的NICD(缩写)并移至细胞核内传导信号。NICD转移至细胞核内后与转录抑制因子RBP－JK结合并吸引共活化物如MAML(缩写)和组蛋白乙酰基转移酶P300/CBP等，从而成为转录活化因子，活化hes等分化拮抗基因的转录，表达产物与相应的分化效应基因的启动子特异性结合并募集Groucho/TLE等转录共抑制因子，对细胞特异性分化效应基因的表达具有阻碍作用，最终影响细胞的增殖、分化和凋亡。该通路称为RBP－JK依赖型信号通路。另有学者提出还可能存在一个RBP－JK非依赖型的信号通路，但至今尚未得到充分论证。

Notch信号通路参与骨骼发育过程

近年来Notch信号通路在骨骼发育中作用的研究逐渐增多，最早报道Notch通路可能在体节发生中发挥作用的依据是ConlonRA等在敲除小鼠Notch1基因后发现其胚胎的体节发育出现了延迟和紊乱的现象。骨骼形成和软骨形成是密切相关的，Notch信号通过调节成骨细胞和破骨细胞的分化和功能，从而控制骨形成和重建。

有研究表明在小鼠胚胎中Notch通路调节软骨细胞和软骨前体的发育是通过Cre/loxP途径实现的，该研究还证实了软骨细胞谱中NICD的过表达会降低软骨前体的增殖、抑制肥大软骨细胞的分化，进而导致骨骼发育畸形。同样的，NICD的软骨前体中过表达会抑制生骨节分化从而导致中轴骨发育出现异常。Notch通路抑制骨骼发育的作用是通过抑制Sox9的表达实现的。Zanotti等还发现Notch1和Notch2的失活导致网状骨增多和皮质骨厚度降低。

另外，Notch1和Notch2在成骨细胞前体中的表达能调节网状骨的容积和微结构。这些研究均表明Notch信号转导通路是通过调节成骨细胞前体的分化来发挥作用，而不是通过影响成熟的成骨细胞功能来调节的。目前研究发现Notch通路既可以依赖于成骨细胞而调节破骨细胞生成，也可以***地调节破骨细胞分化。Notch信号诱导成骨细胞中Osx－Cre及Dmp1－Cre的表达进而抑制破骨细胞形成和骨质吸收。因此，C**is等发现成熟成骨细胞和骨细胞中Notch过度表达通过抑制破骨细胞形成和骨质吸收来增加骨小梁骨量。另有研究证明，Notch1和Notch2在骨形成过程中的作用并不相同。活化的Notch1在破骨细胞前体中能防止其分化为成熟破骨细胞，而活化的Notch2则增强破骨细胞形成。

Notch信号转导通路不仅通过调节成骨细胞和破骨细胞的分化来发挥作用，还能通过影响炎症因子的功能来进行骨骼重建。Dishowitz等研究发现，Notch信号通路能够影响骨折愈合的过程，一方面是通过影响炎症过程、炎性细胞和炎症因子起作用，另一方面是通过影响骨的形成起作用。他们发现Notch信号受到抑制后，导致中性粒细胞数量明显增多以及炎性因子表达时间延长，即急性炎症阶段持续时间更长，反应增强，炎症更重。在对转基因小鼠模型(Mx1－Cre；dnMAML(f/－)研究中发现，Notch信号受抑制后过强的炎症反应会导致小鼠过早死亡。因此，Notch信号通路能够阻止骨折急性炎症期过长、炎症反应过重。

在转基因小鼠骨折模型中，被抑制的Notch信号对骨折早期骨痴形成的影响与对照组比较没有明显统计学差异，而在后期骨折修复过程中明显影响骨骼成熟度和骨结构的重建，被抑制的Notch信号降低了骨骼中成骨细胞的浓度。通过μCT观察小鼠连续20周骨折愈合情况发现与对照组比较Notch信号受抑制小鼠骨的体积分数BV/TV明显升高。这可能是由于Notch信号受抑制导致了骨质形成的体积减小而没有减少骨的数量，该实验还观察到骨小梁的厚度明显增加而骨连接的数量减少，这就意味着骨的结构发生了改变。通过该实验可以看出，在骨折愈合早期Notch信号通过调节炎症反应间接影响骨折愈合过程，而在后期则是通过作用于成骨细胞影响成骨形成从而直接对骨折愈合产生作用。

目前大多数已报道的研究是关于Notch1和Notch2在骨形成和分化中的作用，对于Notch3和Notch4与骨形成和重建的关系的研究并不深入。

Notch信号通路与骨肉瘤的关系

2004年Kawakami等发表的文献中，在1例上颌骨肉瘤患者OS细胞的免疫组化中找到了Notch1受体表达，并进一步得出Notch1基因和OS细胞的分化有密切联系。该文献是最早发表的关于Notch信号通路与骨肉瘤的研究文献。随着各种体内外研究逐渐发现Notch通路参与骨肉瘤细胞的增殖、分化、凋亡、侵袭性、转移性及耐药性等的调控。研究发现阻断Notch信号通路可抑制骨肉瘤细胞的增殖。Li等在绝大多数受检测的OS细胞系中发现均存在Notch1、Notch2及Notch3基因信号，Notch1及其下游基因的表达减少，从而抑制OS细胞的增殖和转移。

不仅如此，进一步研究还发现在骨肉瘤细胞肿瘤形成过程中成骨的形态形成蛋白能够逆向调节Notch信号通路。Engin等发现在三种骨肉瘤细胞系中，经GSI阻断Notch信号通路后，细胞增殖均出现受抑制表现。在体内裸鼠模型试验中，阻断Notch信号通路后肿瘤生长明显受抑制。Dailey等通过RT－qPCR及基因序列分析也发现Hes－1、Hey－1、Notch1和Notch2在骨肉瘤组织中是高表达的，并认为Notch信号通路的活化会促进犬的骨肉瘤细胞增殖发育，Mdder等在U2OS骨肉瘤细胞系微点阵分析中也发现了类似结果。

Mu等对具有高侵袭性的K7M2细胞系和有限侵袭性的K12细胞系进行研究发现，相对K12细胞系在K7M2细胞系中Notch基因(Notch1，2，4)及Notch信号通路下游靶点Hes－1和Stat3表达上调，表明Notch信号通路在K7M2细胞系中更加活跃。他们还发现K7M2细胞系显示更高的醛脱氢酶(ALDH)活性，通过抑制Notch信号通路能够降低K7M2细胞系ALDH活性，因此，ALDH活性可能是Notch信号通路调节过程的一部分。在体外研究中Notch信号通路和增强对氧化应激、迁移、侵袭及VEGF表达的抵抗力有关，但是抑制Notch信号并没有明显地改变K7M2细胞的增殖。Zhang等研究发现，通过药物学和逆转录抑制阻断Notch通路后并没有对骨肉瘤细胞的增殖、存活、侵袭及贴壁依赖性生长产生特别影响。Tanaka等认为，相关文献报道的差异性是由于选择不同的OS细胞系或阻断剂造成的。

Notch信号通路与骨肉瘤细胞的侵袭和转移密切相关。Zhang等和Hughes研究发现，Notch基因(Notch1，Notch2)和靶基因Hes－1在未转移和已转移的骨肉瘤细胞系中均表达。该研究表明，通过GSI阻断Notch通路能够降低骨肉瘤细胞的侵袭性。通过调控Notch信号通路发现Hes－1基因的表达与骨肉瘤细胞的侵袭性和远处转移有密切联系。Zhang等研究还发现，Deltex－1和Hes－1彼此抑制。Deltex－1能够与胞内段结合后泛素化并降解ICN来阻断Notch通路，而Hes－1能够直接与Deltex－1上游的启动子结合从而抑制Deltex－1的转录。

Notch通路的调节作用往往取决于激活下游的Hes1－7、DTX1－4和HERP1－3来实现，该研究还发现，在COL细胞系中DTX－1表达升高而Hes－1表达降低，抑制Notch通路后对细胞的侵袭性及转移性未发现特别变化，但在Hes－1高表达的OS细胞系中抑制Notch通路效果明显。Engin等提出骨肉瘤细胞的侵袭和转移可能与骨成骨细胞p53基因缺失致Notch通路激活、Osterix和细胞周期蛋白表达上调并抑制Runx2有关。关于化疗药物联合抑制Notch信号通路对骨肉瘤细胞的影响研究较少，Ma等研究发现MTX联合Wnt－β－连环蛋白和Notch信号通路抑制剂能够最大程度地导致Saos2细胞系的凋亡，他们在上述联合治疗中再加入Hh通路抑制剂之后并没有得到预期的效果。因此他们认为应用当前化疗药物联合Wnt－β－连环蛋白和Notch信号通路的小分子或化学阻断剂能够有效地治疗骨肉瘤患者，特别是复发的和发生转移的骨肉瘤患者，这种联合治疗方案能够有效地提高此类患者的生存率。

小结

综上所述，Notch信号通路与骨肉瘤的增殖、分化、转移、凋亡及化疗药物作用的敏感性密切相关，阻断Notch信号通路，为骨肉瘤的治疗提供了新的途径。虽然目前众多学者对Notch信号通路与骨肉瘤的关系的研究结论尚存较大争议，对骨肉瘤患者进行个体化Notch信号通路靶向治疗方案及长期使用Notch信号通路阻断剂的潜在危险性等认知不完善，但随着人们对分子遗传学、生物化学以及药理学等研究的汇总报告，Notch信号通路的具体作用机制终将被阐明，其作为骨肉瘤治疗的新靶点将具有广阔的应用前景。

来源：中国矫形外科杂志2015年5月第23卷第9期