脑组织移植治疗帕金森病

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1.1. 帕金森病(PD)的发病基础

　　帕金森病(PD)的发病基础是黑质－纹状体的病变，此系统的多巴胺，去甲肾上腺素及5－HT等抑制性递质的含量降低或缺乏，而兴奋性递质如乙酰胆碱，组织胺的含量相对增加，可导致不自主运动，即震颤麻痹。帕金森病为脑组织移植治疗的可行病种，若将能合成多巴胺的组织或细胞植入黑质－纹状体系统，从理论上讲能对帕金森病起到治疗作用。早期的临床研究为肾上腺髓质移植，Backlund 于1982年为一例晚期PD患者行自体肾上腺髓质尾状核头部的移植，此后的2年内，又进行了2例移植手术，但靶点为一侧的壳核，术后患者症状有明显的改善。此后，随着研究工作的逐步开展，手术方式有了明显的改进，移植物的范围也大大增宽，并且相应的基础研究也迅速得到了开展[14-16]。

　　1.2. 脑移植治疗帕金森病的原理

　　脑内移植物（包括自体肾上腺髓质，胚胎黑质，交感神经节，以及培养的嗜铬细胞等）具有神经内分泌功能，可释放单胺类物质或多巴胺神经介质以激活纹状体内的多巴胺受体，并修复受损的神经组织，由此达到治疗目的。脑内移植物在受体脑内存活、再生和建立突触后，可通过以下5个方面发挥作用：①移植物起到一微小的药物泵的作用并缓慢弥漫的释放神经介质；②通过移植物的细胞再生作用，可修复受损的中枢神经组织；③移植物同受体脑组织的神经细胞建立新的神经传导环路；④移植物可释放对脑内神经元起促进和激活作用的神经营养因子；⑤移植物可发挥桥梁和支架作用，使受体神经元的轴突沿着这一通道延长并选择性的到达靶点部位。关于移植物同宿主细胞产生突触联系已被广为证实，体内微透析实验则证实纹状体内移植物可自我调节多巴胺的释放和代谢，以避免局部多巴胺的浓度过高或过低[17-19]。

　　1.3. 脑移植治疗帕金森病的适应证

　　①经确诊的原发性帕金森病（PD）；②年龄65岁以下，头颅CT, MRI正常；③服用美多巴或左旋多巴等药物有效，但疗效不断下降，或出现严重副作用；④无其他系统严重疾病，自愿接受手术，且得到家属支持。

　　1.4.移植物的种类和制备方法

　　1.4.1. 肾上腺髓质

　　肾上腺髓质为一种富含嗜铬细胞的非神经组织，将它植入到中枢神经系统后能够存活并能分泌去甲肾上腺素。由于可取自自体，这样就解决了免疫排斥问题，因而早期人们在肾上腺髓质移植方面投入的精力较大。后来研究发现移植后1年内效果较好，随着时间的延长，效果越来越差，3年后几乎没有疗效，组织学亦发现移植一年后存活的细胞越来越少，3年后几乎无细胞存活。此提示肾上腺髓质作为一种非神经组织，很难与脑组织性相容。肾上腺髓质移植主要通过以下2个方面发挥作用：①移植到脑内的肾上腺髓质可通过释放多巴胺为纹状体提供神经递质；②肾上腺髓质可产生某种神经营养因子，从而**宿主脑内尚存活的神经组织生长[17,20]。

　　制备：可选用自体和胎儿肾上腺髓质，制成大小为1毫米见方的组织块备用。胎儿肾上腺髓质组织取出后即刻移植和培养后移植。若需培养，先将异体肾上腺组织用Hanks氏液冲洗2次，按50毫克湿重肾上腺髓质组织放置一培养皿中，放入加有10％小牛血清的RPM11640，PH7.2的培养液中，在37℃恒温，5％二氧化碳和95％空气湿化的二氧化碳培养箱中培养。每隔48小时更换培养液，留取组织检查，培养时间为14天。

　　1.4.2 胎脑黑质

　　研究发现胎脑黑质移植到脑内，不但能长期存活，还能与宿主神经元发生突触联系，因而可改善帕金森病患者症状。有人发现植入脑内的胎脑黑质有发育延迟现象，在移植早期多巴胺能神经元是孤立存在的，跟周围宿主组织不发生联系，随着时间的延长，移植的多巴胺能神经元能对宿主神经元建立再支配作用。一般再移植术后3个月可见到毛细血管长入移植组织块，长入方向是从周围向中央推进。因此在行组织培养时，移植的组织块不能太大，否则不利于组织块获取营养。胎脑组织移植后易成活可能与以下几个因素有关：①胎脑组织缺乏主要组织相容性复合体（MHC）表面标记，因而不易被宿主免疫系统识别；②胎脑组织对缺氧的耐受性强；③胎脑组织不但含有多巴胺能神经元，还含有神经胶质细胞，神经胶质细胞可释放神经生长因子，从而促进神经组织生长。

　　制备：将胎儿黑质（包括其他中脑组织）制成1－1.5立方毫米的组织块，置入容量为400ul的刻度试管内，加入200－300ul含有胰蛋白酶的孵育液，于37℃孵育20分钟。取300－350ul碱性液，用注射器抽取，共分4次注入试管内，将试管内原有的孵育液逐步置换出，以洗去其中的胰蛋白酶。用Pasteur吸管插入试管内，做反复的洗－注动作20－25次，勿太用力。将组织块搅碎，制成单细胞悬液，切勿将气泡混入悬液中。为使含有结締组织的絮状悬液缓慢沉淀并重新聚集，所以每隔30－60分钟需按前法用吸管进行反复搅拌。悬液置于室温下。至少经3－3.5小时的制备过程后，方可使用。

　　1.4.3 自体颈上交感神经节移植物

　　颈上交感神经节(SCG)富含去甲肾上腺素能神经元，属于周围神经组织，1976年首次报道作为脑移植供体植入脑内并获得成功。1988年日本学者发现SCG除含有去甲肾上腺素能神经元外，还含有多巴胺能神经元。近年来研究发现帕金森病患者脑内除多巴胺能神经元存在异常外，去甲肾上腺素能神经元也存在异常，由此从理论上证明颈上交感神经节移植具有其独特的优势。动物实验和临床研究亦证实了自体颈上交感神经节移植的有效性。但颈上交感神经节移植也存在缺点：①自体颈上交感神经节体积小，有时无法满足移植手术要求；②颈上交感神经节为人体必需的结构，切除后会引起副作用；③需行2次手术。

　　制备：患者取左侧卧位。于右颌下，上起乳突下缘，下至第4颈椎横突平面，做"L"型切口，逐层切开，直至右颈动脉鞘。然后沿该鞘内侧分离，找到第4颈椎，向上分离至2－3颈椎平面，然后找到颈上交感神经节。神经节为纺锤型，长约2cm，中心直径0.5cm，无明显包膜，质软（须与淋巴结鉴别）。切下神经节后，结扎残端。将神经节制成组织块。

　　1.4.4 基因工程细胞

　　随着分子克隆及转基因技术的发展，基因治疗治疗帕金森病成为可能。在体外对供体细胞用基因重组技术导入或删除某一或某些基因以改变细胞的表型（包括生长特性、对毒物的抵抗力以及分泌某些治疗性蛋白等），称为细胞遗传学修饰，经遗传学修饰的细胞称为基因工程细胞。用于治疗帕金森病的基因工程细胞主要有导入TH或NGH基因的成纤维细胞、成肌细胞、星形胶质细胞、中枢神经细胞等。在进行中枢神经系统疾病的基因治疗时，应注意以下几点：①用于基因转导的细胞能在中枢神经系统中生存且没有侵袭性；②修饰后的细胞具有稳定的表达治疗性产物的能力；③治疗性产物可在体内调节以达到适当的浓度。动物实验研究表明适于基因修饰及脑内移植的细胞应为自体细胞，目前应用较多的为成纤维细胞和成肌细胞，上述两种细胞可在脑内存活1年以上且能有效的释放治疗性产物。

　　制备：基因工程细胞的制备分以下三个步骤：①运载细胞－成纤维细胞、成肌细胞或其他细胞的培养；②带有TH或NGH基因的质粒的重组；③质粒转染培养的运载细胞。（取临床消毒后流产胎儿（胎龄4个月）皮肤，剪碎后用0.1%胰蛋白酶消化30min，血清中和后离心去上清：Hanks液洗1～2遍，用含10％胎牛血清的DEME培养基反复吹打，制成细胞悬液，将其按5×105的细胞密度接种于50ml培养瓶中进行培养）

　　1.4.5 神经干细胞

　　九十年代初期神经干细胞概念的提出，打破了以往认为胚乳动物中枢神经系统神经元不能再生的认识，是理论上的重大突破。神经干细胞作为干细胞有以下特点：①有增殖能力；②在整个生命过程中能自我更新及维持；③具有向多细胞系分化的能力；④损伤或疾病能**干细胞的分化。神经干细胞以其分裂增殖能力、多分化潜能、良好的自我更新等生物学特性，成为神经系统疾病一种新的治疗策略。人们已经从胚胎及成年脑组织中分离纯化出神经干细胞，并已用于研究，取得了较好的效果。Svendsen等将神经干细胞植入大鼠帕金森病模型的纹状体，可见分化为TH阳性神经元。

　　制备：神经干细胞的制备主要有以下3种方式：①胚胎干细胞的定向诱导:胚胎干细胞（ES）具有分化能力，通过改变其培养基成分可定向诱导为某一专能干细胞，Fraichard将ES放在含有维甲酸的培养基中，发现ES可分化为星形细胞、少突胶质细胞及GABA能和胆碱能神经元，说明RS能被维甲酸定向诱导为神经干细胞；②胚胎组织分离：神经干细胞可从发育中的神经上皮中分离，Johe等对怀孕14天的大鼠皮层、纹状体和海马组织进行消化、培养，通过克隆分析证明神经干细胞在胚胎脑内大量存在，Mayer从怀孕10.5天鼠胚中分离出神经上皮干细胞；③成年脑组织中分离：Reynold和Weiss从3～18个月小鼠脑分离海马，消化后种植到有表皮生长因子的无血清培养基中，少数细胞成活并形成细胞团，这些细胞nestin反应阳性，且具有神经终丝，首次证明成年脑中存在神经干细胞，此后又从脑的不同部位分离出神经干细胞[2,21]。

　　1.4.6 联合移植

　　将两种和两种以上的移植物同时植入靶区，使其发挥协同作用称为联合移植。目前采用的联合移植有：黑质和肾上腺髓质联合移植；黑质、下丘脑及脑干导水管旁组织的联合移植；雪旺氏细胞与胎儿肾上腺髓质联合移植等。实验证明采取联合移植比单纯移植效果要好。

　　1.5 移植术前准备

　　除常规术前临床查体，化验外，还应常规查EEG，EMG，CT，有条件者查脑脊液中多巴胺含量，淋巴细胞转化率及淋巴细胞抗体试验等。

　　1.6 移植方式

　　脑移植之所以能对帕金森病起到治疗作用，在于他能补充脑内黑质纹状体系统多巴胺的不足，但由于选择的移植部位和技术的不同，疗效也有所不同。目前常采用的移植部位有：尾状核头部、壳核、中脑黑质、侧脑室等。移植方式有开颅直视下移植法及立体定向移植法。

　　1.6.1 开颅直视下尾状核头部移植法

　　行右额小骨瓣开颅后，在额中回做脑室穿刺，确定侧脑室额角后，行皮质造瘘，在手术显微镜下辨认出尾状核头部，用吸引器在尾状核头部制造一5×5立方毫米的腔隙，将制备好的移植物多靶点置入该腔隙内，取明胶海绵用细针头多处穿刺制成筛状后，覆盖在移植腔隙的开口之上，并压入腔隙的室管膜下，使移植物能与脑室液接触而获得营养物。

　　1.6.2 立体定向尾状核头部移植法

　　用脑立体定向仪，选择右侧（左利手者取左侧）尾状核头部1－2个靶点，靶点定位在前后联合连线中点前方15毫米，向上15毫米，旁开10毫米处。定位后，插入直径2毫米，带有侧孔的硅胶管，将移植物分次注入靶点，每次2－3毫升，一般移植2－3次。

　　1.7 移植术后处理

　　①研究发现脑为一部分免疫特免器官，脑移植物可诱发受体产生系统性免疫反应，故移植前后应用免疫抑制剂可使移植物的存活率大为提高，常用的免疫抑制剂为环孢素A，用量为13毫克/公斤体重/日，2周后改为11毫克/公斤体重/日；②常规应用抗生素以预防感染；③应用抗震颤药。

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脑组织移植治疗帕金森病，费用大概是多少