肝细胞癌MRI动态增强表现的血供基础研究

老*驼

[摘要]  目的  明确肝细胞癌MRI动态增强表现的微血管基础。方法  用二乙基亚硝胺长期小剂量灌喂大鼠诱发肝细胞癌，于不同时间行MRI动态增强扫描，并且在相应部位取材做病理、电镜及MVD测定。结果  41个结节做MRI动态增强扫描，绘制时间-信号强度曲线，可见曲线形态与肿瘤MVD有关，快速上升型曲线肿瘤的MVD值高，缓慢上升型曲线肿瘤的MVD值低。结论  MRI动态增强扫描可以客观的反应肿瘤的血供情况，有助于临床进一步治疗。
    [关键词]  肝细胞癌；磁共振成像；动态；微血管密度；大鼠
    肝细胞癌的MRI研究在国内外已有较多的报道[1，2]，但就其动态增强表现与肿瘤血管之间对照研究极少报道，我们建立大鼠肝细胞癌模型，观察肝细胞癌MRI动态增强表现，并且与相应部位MVD及电镜结果进行对照研究，以提高对肝细胞癌动态增强MRI表现的认识。
    1  材料和方法
    1.1  动物模型的建立  健康清洁级雄性Wistar大鼠90只，9-11周龄，体重150-180 g，随机分为实验组和对照组，其中实验组80只，对照组10只，分笼饲养。实验组大鼠灌喂2‰二乙基亚硝胺生理盐水溶液，每日一次，每次1 ml，每周5次，剩余2日自由饮水。灌喂满14周后停药，大鼠自由饮水。对照组以同样的方法灌喂等量的生理盐水。
    1.2  MRI动态增强扫描  实验组大鼠分别于灌喂后第16、18、20、21、22、23、24、25周行MRI检查，每次随机取5只大鼠，第25周取4只共取39只大鼠，对照组每次取1-2只。采用美国GE公司Signa Contour型0.5 T超导型磁共振成像系统和8 cm环形表面线圈。先行MRI平扫，检查结束后，选取肿瘤最明显的两相邻层面，采用快速多层面扰相梯度回波(FMPSPGR)序列T1WI，TR＝5l ms，TE＝5 ms，翻转角80°，层厚＝3 mm，层间距＝0，FOV＝12 cm。先于未增强前行MRI平扫一次，扫描结束后，立即通过颈外静脉留置导管快速注入Gd-DTPA 0.8 ml，2 s内注完。从开始注射造影剂时行MRI扫描，最小间隔时间扫描5 min。观察肿瘤增强情况，选定肿瘤或邻近的正常肝脏的某一感兴趣区绘制时间-信号强度曲线，观察曲线形态。
    1.3  肿瘤MVD测定  对照MR影像，按照扫描层面对应部位取材，采用兔抗大鼠CD34多克隆抗体，按常规SP法进行免疫组化染色。先在低倍镜下(×100)全面观察切片以确定肿瘤内血管密度最高处，然后在高倍镜下(×200)计数。微血管计数选择标准：凡是染成棕黄色、单个或数个内皮细胞均作为一个血管计数。不以红细胞的出现来确定是否有血管，也不以是否出现管腔来计数血管，管腔大于8个红细胞直径，带有较厚的肌层的血管也不作为血管计数。记录5个视野内的微血管数，取其平均数作为该肿瘤的MVD(单位：个／视野)。
    1.4  电镜观察  取其中8个标本做电镜观察。将标本切成1mm3左右的小块，置于4℃ 3％戊二醛溶液中固定。48 h后用0.1 mol PBS溶液漂洗，l％***固定，梯度丙酮脱水，饱和醋酸铀块染过夜；然后再用梯度丙酮及含氯化钙的100％丙酮脱水，环氧丙烷置换，环氧丙烷和环氧树脂混合液浸透；最后用纯包埋剂浸透，烤干，超薄切片，经醋酸双氧铀-柠檬酸铅双染色，透射电镜观察。
    1.5  统计学处理  所有资料均用统计软件包SPSSl0.0处理。计量资料用均数士标准差表示，采用单因素方差分析。
    2  结果
    2.1  动物诱癌情况  诱癌成功39只大鼠，共41个结节做动态增强扫描。肝脏大体观察见肝硬化不明显，部分肝脏可见肿胀。全肝弥散分布大小不等的灰白色结节，结节大小差异很大，部分结节与周围组织有粘连。
    2.2  动态增强MRI  选取肿瘤内某一感兴趣区，将各时相点所采集图像的信号强度连成曲线，根据曲线上升幅度及持续时间的不同可将曲线分为四型，①速升速降型(Ⅰ型)：曲线快速上升，然后较快下降。②速升缓降型(Ⅱ型)：曲线快速上升，未见明显的下降趋势。③缓慢上升型(Ⅲ型)：曲线上升较平缓，呈持续上升。④轻微增强型(Ⅳ型)：在整个检查过程中，曲线仅轻微上升。结果显示正常肝实质的时间-信号强度曲线较平坦，变化幅度较小，表现为Ⅳ型曲线。肝细胞癌的时间-信号强度曲线在注药后上升较快，曲线形态表现为Ⅰ-Ⅲ型，未见Ⅳ型曲线。
    2.3  电镜观察见癌细胞排列极不规则，失去了正常组织学的结构特点，核大小不一，外形不规则，数目增多，核浆比例增大，核膜增厚，癌细胞胞浆内线粒体减少，呈空泡化变性，粗面内质网囊呈层状排列，细胞间连接复合体减少，间隙增宽。血窦内皮细胞均为无孔型，细胞核增大，线粒体肿胀，内皮下可见基底膜，并且基底膜的形态各异，部分肿瘤基底膜连续，厚薄较均匀，而部分肿瘤基底膜可见断裂不完整，甚至可见局部断裂、片状缺失及大部分消失等不同程度的改变。
    2.4  微血管密度  CD34免疫组织化学染色结果，正常肝组织的血窦不着色，汇管区极少量大血管阳性染色，但不符合微血管计数标准。肝细胞癌血窦内皮细胞均见不同程度的黄染，16例表现为Ⅰ型曲线的结节其MVD值为44.4±7.2，Ⅱ型曲线的结节其MVD值为38.4±6.0，而Ⅲ型曲线的结节其MVD值为27.1±4.3，不同曲线之间其MVD值差异显著。
    3  讨论
    3.1  大鼠肝癌模型的建立  目前已经建立并且应用的肝细胞癌模型种类较多，按照方法的不同可分为种植型和诱发型两型，其中种植型肝细胞癌模型虽然方法简单，耗时较短，但就其血供来讲，相当于转移性肿瘤，与原发性肿瘤血供特点存在着一些差异；而诱发型模型虽然耗时较长，但与人原发性肝癌形成相似。我们结合以往文献报道，选用二乙基亚硝胺(DEN)，小剂量持续给药的方式进行诱导，成功地建立了大鼠肝细胞癌模型。此模型适合影像学研究。
    3.2  MRI动态增强扫描表现的血供基础  众所周知，血管在肿瘤生长及转移过程中发挥着极其重要的作用，若肿瘤缺乏血管而供养不足，肿瘤就不能增殖，反之，肿瘤一旦有血管长人，就会急剧发展，并且可以发生转移[3-5]。对于肿瘤血供丰富程度的判断主要是通过评价肿瘤的微血管密度，以往主要是通过获取癌组织标本，进行免疫组化染色而得出肿瘤微血管密度值，但该方法繁琐，费时，且结果仅能反应肿瘤极小区域血管生成情况。
    近来随着影像新技术的迅猛发展，尤其是MRI的应用，
在肿瘤诊断方面显示出越来越突出的优势。而MRI动态增强扫描不仅可以更好的提高对肿瘤的诊断，还可以通过观察肿瘤增强情况，绘制时间-信号强度曲线，客观的反应肿瘤的血供情况及判断肿瘤恶性程度。Buadu等[6]将73例乳腺病变的MR时间-信号强度曲线分为四型，发现曲线的类型及升段最大斜率与肿瘤MVD的高低有关，斜率越大，肿瘤MVD值越高；Yamashita等[7]认为MR动态增强形式和程度可反应肝细胞癌的分化程度、组织结构和血流动力学。
    本实验中所使用的造影剂为G&DTPA，是一种细胞外间隙非特异性／顷磁性对比剂，体积小，进入血管后可以快速地从血管内进入细胞间隙，并且在各组织中的分布情况可因组织的血供及微血管通透性的不同而异[8,9]。因此动态观察造影剂引起肿瘤信号的变化，可以较好地反应肿瘤血管的分布及丰富情况。在实验中我们选取肿瘤内某一感兴趣区；将动态增强时各时相点对应的信号强度值连成曲线，该曲线反映了注入造影剂后靶区信号随时间而发生的动态变化，通过观察肿瘤感兴趣区的动态增强曲线形态，并且与该区肿瘤的MVD值进行对应观察，我们发现曲线的形态与肿瘤的MVD值之间存在一定的相关性，缓慢上升型曲线其MVD值较小，速升缓降型曲线其MVD值较大，而速升速降型曲线其MVD值最大，并且此三型曲线其MVD值之间存在统计学差异。以往研究及我们在电镜观察中均发现，肿瘤细胞间的连接复合体减少，细胞间隙增大，血管内皮下基底膜不完整，甚至部分缺如。当肿瘤MVD值较小时，单位体积内血管数量较少，早期进入肿瘤血管并且通过不完整的基底膜及细胞连接渗入到细胞间隙内的造影剂相对较少，信号强度增加较小。随着时间的延长，血液中造影剂不断向细胞间隙弥散，而造影剂从细胞间隙向肿瘤血管内排空相对较缓，一定时间内肿瘤信号强度不断增加，故曲线呈现缓慢上升型；当肿瘤MVD值大时，单位时间内进入肿瘤内部的血液较多，早期即可见大量的造影剂进入到肿瘤血管并渗入到细胞间隙内，致信号强度增加较大，随着时间的延长，造影剂不断从细胞间隙排人肿瘤血管内而廓清，肿瘤的信号也随之降低，故曲线信号达峰值的时间较短，曲线形态表现为速升速降型，但部分表现为快速增强后缓慢的降低，潘平等[10]认为可能由于肿瘤丰富的微血管导致造影剂在其中潴留、排空缓慢所致，也可能与顺磁性对比剂的增强机制及肿瘤细胞外间隙的大小有关。
    因此，我们可以看出，通过观察肝细胞癌动态增强MRI时间-信号强度曲线形态，可以客观的反应肿瘤内某区域的血供情况，当曲线形态表现为快速上升型时，该区域肿瘤的MVD值较大，而当曲线早期上升较慢时，则该区域的MVD值较小。此方法简单方便，只需做MRI动态增强扫描，选定某一感兴趣区，绘制时间-信号强度曲线，通过观察曲线形态，即可得知该区域肿瘤的血供情况，可为临床判断肿瘤血供情况提供一条方便、准确、快捷的方法。

r****6

j见识了，学到不少新的东西，只可惜是在动物身上的。不知可以用到人身吗？

c****5

hao,非常精彩！