肿瘤标记物具体实验操作步骤

z****9

免疫荧光分析肿瘤标记物具体实验操作步骤：

食管癌：癌胚抗原CEA （carcinoembryonic antigen），糖类抗原SCC （squamous cell carcinoma antigen）；

贲门癌：糖类抗原50 CA50（carbohydrate antigen），癌胚抗原CEA（carcinoembryonic antigen），糖类抗原19-9 CA199（carbohydrate antigen）糖类抗原72-4 CA72-4（carbohydrate antigen）；

肺癌：癌胚抗原CEA（carcinoembryonic antigen），可溶性细胞角蛋白组(Cytokeretin 19 Fragment)，神经特异性烯醇化NSE（neuron specific enolase），糖类抗原SCC（squamous cell carcinoma antigen）。

z****9

有人帮助解答一下吗，检验科的同事们，先谢谢了

t****7

从网上找到的资料，希望对你有用：
一.  直接免疫荧光法测抗原



基本原理

        将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少，相对使用标记抗体用量偏大。

试剂与仪器

          磷酸盐缓冲盐水(PBS)：0.01mol/L，pH7.4

          荧光标记的抗体溶液：以 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 进行稀释

          缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油 9 份+ pH9.2 0.2M 碳酸盐缓冲液 1 份配制

          搪瓷桶三只(内有 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 1500ml)

          有盖搪瓷盒一只(内铺一层浸湿的纱布垫)

          荧光显微镜

          玻片架

          滤纸

          37℃温箱等。

实验步骤

1.  滴加 0.01mol/L，pH7.4 的PBS于待检标本片上，10min后弃去，使标本保持一定湿度。

2.  滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全覆盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温一

30min  

定时间(参考：30min)。

3.  取出玻片，置玻片架上，先用 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 冲洗后，再按顺序过0.01mol/L，

pH7.4 的 PBS 三缸浸泡，每缸 3-5 min，不时振荡。

4.  取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。

5.  立即用荧光显微镜观察。观察标本的特异性荧光强度，一般可用“+”表示：

(-)无荧光；(±)极弱的可疑荧光；(+)荧光较弱，但清楚可见；(++)荧光明亮；(+++

--++++)荧光闪亮。待检标本特异性荧光染色强度达“++”以上，而各种对照显示为(±)

或(-)，即可判定为阳性。



注意事项

1.  对荧光标记的抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有一定的浓度，一般稀释在 1：20-100 之

间，要自行摸索最佳梯度，建立最好的稀释比例，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，

影响结果的观察。

2.  染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从 10 min 到数

小时，一般 30 min 已足够。染色温度多采用室温(25℃左右)，高于 37℃可加强染色效果，

但对不耐热的抗原(如流行性乙型脑炎病毒)可采用 0-2℃的低温，延长染色时间。低温染

色过夜较 37℃30 min 效果好的多。

3.  为了保证荧光染色的正确性，首次试验时需设置下述对照，以排除某些非特异性荧光染

色的干扰。

(1)标本自发荧光对照：标本加 1-2 滴 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS。

(2)特异性对照(抑制试验)：标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗

体。

    如果标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，  待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。

4.  一般标本在高压汞灯下照射超过 3min，就有荧光减弱现象，经荧光染色的标本最好在当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降。

二.    间接免疫荧光法测抗原



基本原理

染色程序分为两步，第一步，用已知未标记的抗体(待检标本)加到已知抗原(待检标本)

标本上，在湿盒中 37℃保温 30min，使抗原抗体充分结合，然后洗涤，除去未结合的抗体。

第二步，加上荧光标记的抗球蛋白抗体或抗 IgG、IgM 抗体(通常为荧光标记的对应二抗)。

如果第一步发生了抗原抗体反应，标记的荧光标记的二抗就会和已结合抗原的抗体进一步结合，从而可鉴定被检测抗原。

试剂与仪器

          磷酸盐缓冲盐水(PBS)：0.01mol/L，pH7.4

          缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油 9 份+ pH9.2 0.2M 碳酸盐缓冲液 1 份配制。

          荧光标记的抗人球蛋白抗体：以 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 进行稀释  。

          搪瓷桶三只(内有 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 1500ml)

          有盖搪瓷盒一只(内铺一层浸湿的纱布垫)

          荧光显微镜

          玻片架

          滤纸

          37℃温箱等。

实验步骤

1.  滴加 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 于未知抗原标本片，10min 后弃去，使标本片保持一定湿度。

2.  滴加以 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 适当稀释抗体，覆盖未知抗原标本片。将玻片置于有盖搪瓷盒内，37℃保温 30min。

3.  取出玻片，置于玻片架上，先用 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 冲洗 1-2 次，然后按顺序过0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 三缸浸泡，每缸 5min，不时振荡  。

4.  取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，滴加一滴一定稀释度的荧光标记二抗

5.  将玻片平放在有盖搪瓷盒内，37℃保温 30min。

6.  重复操作 3。

7.  取出玻片，用滤纸吸去多余水分，滴加一滴缓冲甘油，再覆以盖玻片。

8.  荧光显微镜高倍视野下观察，结果判定同直接法。

注意事项

1.  荧光染色后一般在 1h 内完成观察，或于 4℃保存 4h，时间过长  ，会使荧光减弱。

2.  每次试验时  ，需设置以下两种对照：

  

(1) 阴性对照：阴性血清+荧光标记物   (需有使用人员自行建立标准)

(2) 荧光标记物对照：PBS+荧光标记物

如果标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，  待检标本呈强荧光，则为

特异性阳性染色。  

3.  未知抗原标本片需在操作的各个步骤中，始终保持湿润，避免干燥。

4.  所滴加的抗体或荧光标记物，应始终保持在未知抗原标本片上，避免因放置不平使液体流失，从而造成非特异性荧光染色。