求助，核仁区相关蛋白的银染法步骤．急

罗*卿

我做细胞爬片，想看细胞处理后增殖能力的改变，想用银染法染色细胞片，谁知道步骤？越详细越好，谢谢

t****x

SSCP(银染法)大概步骤为:
1.固定2.染色3.显色4.终止显色
PCR-SSCP的实验操作  在进行SSCP前首先要通过PCR扩增出特异性好的产物(琼脂糖电泳不能有过强的拖尾).

1)制备聚丙烯酰胺凝胶(PAG)
　　
　　 按上表制所需的胶液，将梳子插入模子，从梳子一端加入胶，当胶液快到梳齿时，使 模子向加胶端倾斜，继续慢慢加胶，边加边放端模子以防止气泡形成，室温放置1h使 之凝固.然后拔掉梳子，顶部加入1×TBE封闭，备用.
　　
　　 2)电泳
　　
　　 取10μlPCR产物，加入10μl变性剂(95%甲酰胺，10mmol/LEDTA0.02%溴酚蓝)、30μl 石蜡油，煮沸5min，取出立刻放入冰浴中2min以上，然后将水相全部上样，10-15℃下 电泳.开始在300V电压下电泳5min，然后在120V电泳8h，取下凝胶，将其浸在含 0.5ug/ml溴化锭的1×TBE缓冲液中染色30--45min，在紫外灯下观察，或进行银染.
　　
　　 3)银染法
　　
　　 将PAG板用去离子水洗二次，浸入10%乙醇和0.5%冰醋酸溶液固定6min.用去离子水洗 二次，再浸入0.2%AgNO3溶液中10min.用去离子水洗3--5次，然后浸入1.5%NaOH和 0.4%甲醛溶液中显色7min.最后，用0.75%NaCO3终止显色.
　　
不知道你是不是做这个，RTPCR-SSCP还是有点区别的如果需要鉴定染色体的DNA序列有无差别或基因突变,可以用PCR-SSCP, ,只要有一个核苷酸的区别,变性SDS-PAGE后,条带就会有很大的区别.而RTPCR-SSCP 检测的是cDNA片段有无区别的实验。

罗*卿

哦，谢谢，不过我目前做的不是这个，不过也许以后就用拉，多谢！
　　我这次做的是细胞片，我好不容易问到了，贴上或许也有人要用啊．
　　１．试剂配制．a液：２％明胶溶液，将２g明胶溶于１００ml甲酸中．
　　　　　　　　　b液：５０％硝酸银溶液
　　２．细胞爬片固定；一般可选乙醇，冷丙酮．我用的是冷丙酮（细胞片PBS冲洗三次，加冷丙酮固定十分钟）
　　３．再用蒸馏水冲洗３次，每次５分钟
　　４．晾干，加a液与b液１：２混成的工作液于细胞片上，室温避光２７－５０分钟.
       5.2%硫代硫酸钠一分钟
       6.蒸馏水冲洗,乙醇脱水,***透明,树脂封片(石蜡切片)
      7.观察细胞质染成棕色,而核仁组织区相关蛋白由于嗜银染成黑棕色颗粒,因此黑棕色颗粒反映了细胞的增殖能力

罗*卿

:handshake 谢谢哦

t****x

请教下。你这个做的应该是普通切片吧？:handshake

罗*卿

是的，好久没来学习了．不好意思