干细胞与组织工程学在眼科中的应用前景

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干细胞与组织工程学在眼科中的应用前景

葛坚

作者单位：510060广州，中山大学中山眼科中心



一、干细胞与组织工程学的基本概念

干细胞是指具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的一类未分化细胞，主要分为两大类：一类是胚胎组织来源，可以分化为3个胚层的各种细胞，如胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESC)；另一类是源于成体组织，能够产生所在特定组织的各种细胞，称为成体干细胞，如骨髓间质干细胞（bone marrow stromal stem cell，BMSC）、神经干细胞（neural stem cell，NSC）、视网膜干细胞以及角膜缘干细胞等。

组织工程学包括4个基本问题：种子细胞，生物支架材料、有助于细胞生长和分化的细胞外基质微环境、移植组织的“获能”与免疫调控。其中获得足够数量、不引起免疫排斥反应且具有再生活力的种子细胞是开展组织工程研究的前提和基础。干细胞恰恰因为其独特的自我更新、高度增殖和多向分化潜能成为理想的种子细胞。通过组织工程学技术，理论上可以将干细胞在人为条件下诱导、分化和培养为任何一种人体细胞、组织或器官。将培养成功的组织器官进行体内移植，则可以完美地修复或替代缺损的组织器官。

二、干细胞与组织工程学在眼科中的应用

目前，眼科学发展存在几个核心问题：眼部新生血管的发生机制和防止；眼表疾病、炎症、移植与免疫调控；自然眼病动物模型的构建；特定眼病致病基因的筛选和功能研究；视功能损害的保护和再生等。干细胞与组织工程学作为一项逐渐成熟的新兴再生技术，则可能是解决上述核心问题的基本途径。干细胞与组织工程学已经在下述眼科领域中取得长足进展。

1. 视网膜视神经变性疾病的神经保护和再生研究：干细胞在青光眼等视网膜视神经变性疾病中的应用标志着一个新的研究领域，即“再生眼科学”的诞生。主要研究包括：（1）建立了微创性视网膜下腔移植和绿色荧光蛋白（GFP）标记干细胞技术，可以对眼内移植干细胞的分化和迁移进行追踪和监测；（2）胚胎干细胞诱导分化为视网膜神经细胞；（3）联合纯化的视网膜Müller细胞和视磺酸（RA），对体外胚胎体（EB）阶段GFP-ESC进行视网膜特异性定向诱导，通过NSC无血清培养基的筛选富集获得视网膜干细胞；（4）实现了诱导ESC向视网膜谱系定向分化，并在体外获得中间阶段的干细胞（即视网膜样干细胞）的实验技术；（5）分化的视网膜神经细胞特异性表达Nestin、S100、GFAP、GAP43、Synaptophysin、Thy1.1和MAP2等抗原；（6）自体来源的成体干细胞诱导分化为神经干细胞和视网膜细胞，为眼科再生治疗提供了新的种子选择。

2.利用干细胞构建三维人工生物角膜及眼表重建：构建人工生物角膜是解决角膜移植供体来源匮乏的有效途径，其中角膜缘干细胞（limbal stem cell, LSC）是关键因素。自体角膜缘干细胞因取材受限实际临床应用指征较狭窄，应用其他干细胞诱导分化为角膜缘干细胞是主要研究方向。我们已经完成胚胎干细胞、骨髓间充质干细胞和皮肤干细胞向角膜缘干细胞（表现干细胞增殖分化特征，且AE5、P63阳性）和角膜上皮细胞诱导分化的实验研究，并且尝试应用聚乳酸与聚羟基乙酸的共聚物（PLGA）和异体角膜基质作为构建角膜基质的支架材料，在实验中将培养和诱导分化的角膜细胞接种到PLGA材料上，构建成角膜细胞-PLGA复合物，初步探讨构建组织工程化三维人工角膜的可行性。另外，以羊膜为载体，利用胚胎干细胞或骨髓间充质干细胞诱导分化的角膜缘干细胞作为种子细胞，实现了实验性眼表重建。

3.应用干细胞技术进行基因打靶，构建自然眼病动物模型：发现眼病相关基因突变与其发病并非直接因果关联，需要在实验动物水平对这些相关基因突变进行功能研究，进而模拟疾病的自然发生过程。需要强调的是目前已有眼病动物模型几乎都不是原发性疾病的自然模型，而且绝大多数建立于啮齿类动物。啮齿类动物细胞的基因调控，细胞生物学特性及功能学表现与灵长类动物明显不同，其研究结果无法直接应用于人类或可能导致理解的偏差和误导。最理想的动物模型是干细胞与基因打靶技术相结合构建的灵长类疾病自然发病模型，有可能模拟人类疾病的自然进程，并在此基础上对发病机制和治疗措施进行系列研究。

三、干细胞研究中亟待正视与解决的关键问题

干细胞与组织工程学研究是生命科学中的新兴学科，我国与国际上还处于比较接近的起跑线上。2004年3月11日Nature杂志特别编辑了“中国专辑”（China Vision），其中“新的丝绸之路”（The New Silk Road）和“胚胎国家”（An Embryonic Nation）对这一问题进行了专题阐述，并作为中国生命科学研究最具前景的重点方向加以评荐。正因为理论及实验室的干细胞与组织工程学表达的美景，致使干细胞研究遍地开花，蜂拥而上。事实上，将个体发育分化如此错综复杂的自然进化伟业还原成干细胞路径，并没有解决从细胞发育成个体的调控机制。应该冷静、客观、审慎地着手开展与评价干细胞研究。干细胞研究中必须正视与解决的基本问题包括：（1）建立系统的技术平台，包括核心技术、设备、人才及研究经验的积累，以及在干细胞领域凝练核心问题的能力。（2）干细胞诱导、分化以及横向分化（transdifferentiation）的调控机制问题。只有明确这些调控机制，才能稳定地将干细胞诱导分化为我们需要的特定发育阶段和组织细胞类型。（3）成体干细胞的特异性标志筛选以及分离提纯问题。（4）干细胞的致瘤性与免疫源性问题。（5）干细胞移植的“获能”问题。干细胞必须被特定受体组织接受，发生结构和功能的整合，这是目前尚未解决的关键问题之一。（6）干细胞研究还涉及伦理学问题，这有待立法和规范化的监督机制。