丁基苯酞对缺血性脑卒中线粒体保护作用的研究进展

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丁基苯酞对缺血性脑卒中线粒体保护作用的研究进展

山东大学齐鲁医院作者：周盛年　文章号：W035174

摘要：丁基苯酞可阻断缺血性脑卒中所致脑损伤的多个病理环节，是一个多靶点治疗药物，具有很好的抗脑缺血和脑保护作用，其治疗机制比较复杂，现就其在线粒体保护方面做一概述。

  丁基苯酞 (Butylphthalide,商品名:恩必普)，化学名称是消旋-3-正丁基苯酞（简称丁基苯酞或记作dl-NBP）,化学式是 C12 H14O2 ,相对分子量是190.24，与芹菜籽中提取出的左旋芹菜甲素结构相同，但dl-NBP是人工合成制得的消旋体[1]，由石家庄制药集团恩必普药业有限公司生产的我国脑血管病治疗领域第一个拥有自主知识产权的国家一类新药，先后获得了15项国内及国际专利，在世界86个国家享受专利保护。多年的动物实验研究证明，dl-NBP可以增加缺血区的脑血流量，改善缺血区脑的微循环,缩小局灶性脑缺血后的梗死面积，减轻脑水肿[2-4];保护线粒体，抗氧自由基，改善全脑缺血后脑的能量代谢[5-8,14-16]；抑制神经细胞凋亡[9],抑制炎症反应[10]，抗血栓形成和抗血小板聚集[11];减轻神经功能损伤，对缺血性脑卒中所致脑损伤的多个病理环节起阻断作用，对其有较强的治疗和保护作用[12,13]。崔丽英等[21-24]经过四期临床研究发现，dl-NBP对缺血性脑卒中的疗效肯定，安全性好，副作用少。线粒体是细胞内能量生成和储存的主要场所，对缺血缺氧极为敏感。在缺血性脑卒中病理发展的过程中，线粒体损伤尤为显著。本文仅对dl-NBP对缺血性脑卒中线粒体保护方面的机制作一概述。

1． 对线粒体超微结构的影响

线粒体超微结构正常是其功能正常发挥的基础。熊杰等[14]研究发现大鼠大脑中动脉阻断3h再灌注3h后，电镜下皮层神经元线粒体的超微结构发生很大变化，线粒体结构严重受损：内外膜间隙增大，膜结构破坏；嵴断裂，减少；线粒体肿胀甚至空泡化。而应用dl-NBP腹腔注射组，线粒体结构基本不受损伤：内外膜结构清晰完整，嵴清晰明显，无断裂和减少；线粒体无明显肿胀。

高钟生等[15]通过丁苯酞注射液对慢性脑低灌注状态大鼠前脑线粒体的超微结构进行研究亦有相似发现：丁苯酞注射液组的线粒体超微结构几乎接近于正常，未见嵴断裂、空泡增多等，有的仅出现粗面内质网腔扩大、线粒体肥大等可逆性损伤。这两个研究均证明dl-NBP对线粒体的超微结构有较好的保护作用。

2． 对线粒体呼吸链复合酶的影响

2.1 动物模型
  熊杰等[5]采用大鼠大脑中动脉阻断 (middle cerebral artery occlusion ,MCAO)-再灌模型，用分光光度法测定局灶性缺血后脑线粒体呼吸链复合酶 I , II , III和 IV 活性的改变,并观察dl-NBP对这些变化的影响。结果显示：线粒体呼吸链复合酶 I 的活性在缺血 1 h 后无变化 ,再灌 3h ,活性明显升高 (由1.148升高到2.572μmolmg - 1min - 1, P < 0.01) ,再灌 6 h后 ,恢复到正常水平。复合酶 II的活性在缺血1h后明显升高(从14.05 升高至 15.95μmol mg - 1min - 1) ,再灌 6 h后 活性反而降低 (降至 12.26 μmolmg - 1min - 1) ,与对照组均有明显差异( P < 0.05) 。复合酶 III的活性在缺血和再灌时无明显变化。复合酶 IV 的活性受缺血影响最明显,缺血当时其活性即显著降低 (由 0.167 降至 0.09 μmolmg - 1;min - 1, P < 0.01) ,再灌后,其活性迅速恢复到正常水平。若缺血前10min给予dl-NBP腹腔注射，可以明显改善由缺血再灌造成的复合酶 I , II活性改变,使之几乎恢复到正常水平。dl-NBP 能明显降低再灌 3 h 复合酶 I活性的升高 ,并恢复至正常水平。对于复合酶 II ,dl-NBP能矫正它在缺血期的活性升高和再灌 6 h的活性降低。dl-NBP 对复合酶 III 的活性基本无影响。dl-NBP对复合酶 IV 的作用最为明显,剂量为5 mgkg - 1即能逆转复合酶 IV 在缺血期显著降低的活性(由缺血期的 0.09 提高到 0.178μmolmg - 1min -1, P < 0.05) ,恢复到正常水平 , 剂量为10 mg kg - 1时作用更强 ,其活性增加到 0.192μmolmg - 1min -1,略高于正常组水平( P < 0.01) ;对再灌后(3h ,6 h)升高的活性略有降低 ,但与正常水平无显著差异。
   MCAO-再灌动物模型对线粒体呼吸链复合酶最重要和最明显的影响就是显著降低了复合酶IV的活性，对复合酶I , II ,III的影响较小。熊杰等研究发现，给予dl-NBP后，不仅明显提高了缺血期急剧降低的复合酶 IV 的活性 ,而且使再灌 3h时升高的复合酶 I 活性降至正常水平,并对复合酶 II表现出双向调节作用 ,使其活性在急性缺血期和再灌期均保持在基本正常水平 ,提示dl-NBP 有益于缺血期和再灌期脑内能量代谢的改善。

2.2 细胞培养
  熊杰等[5,16] 采用原代培养的胎鼠皮层神经细胞，用分光光度法测定低糖低氧处理6h后线粒体呼吸链复合酶IV 活性的改变,并观察dl-NBP对其变化的影响。实验证明，低糖低氧处理6h,呼吸链复合酶IV的活性显著降低。而加入dl-NBP后可使低糖低氧造成的复合酶 V活性降低得到明显逆转。通过细胞培养的方法，可以确定dl-NBP对线粒体复合酶活性的影响，是其直接作用于线粒体的结果，并不是继发于脑血流的改善[17]。

3．对线粒体膜流动性的影响

3.1动物模型

在脑缺血和低糖低氧损伤时，线粒体膜磷脂层的运动发生变化，引起膜流动性降低，通透性增大，这一变化出现在形态学和生化学改变之前，是线粒体损伤比较敏感的观测指标[18]。

线粒体膜保持一定的流动性对保持其功能正常发挥如产能尤为重要的。熊杰等[14]研究发现MCAO 1h 后造成线粒体膜流动性迅速降低 ,表现为微粘度η值的升高。（由 2.736 升高到3.449，P < 0.05）。再灌 3 h,η值虽略有降低, 为3.214, 但仍高于正常组水平, 再灌 6 h,η值自动恢复正常,降至2.639, 说明线粒体的膜功能损伤主要发生在再灌注的早期(1～3 h)。腹腔注射dl-NBP后可以不同程度地恢复 MCAO 引起的线粒体膜η值的升高,尤其是在缺血 1 h, 与对照组有明显差异( P < 0.05) ,说明dl-NBP对缺血再灌造成的脑线粒体膜损伤有良好的保护作用。

3.2 细胞培养

熊杰等[16]对原代培养的胎鼠皮层神经细胞低糖低氧处理后，用荧光分光光度法测定膜的流动性，发现膜的流动性显著降低，膜微黏度明显升高，而加入dl-NBP能够使这种变化得到明显逆转。

4．对线粒体膜电位的影响

线粒体膜电位所形成的电势能是ATP合成中高能磷酸键的能量来源，膜电位的降低势必会影响线粒体的正常产能功能，这些改变最终将会导致线粒体整体功能障碍。熊杰等[14]采用Rhodamine123标记线粒体的方法对膜电位进行检测，Rhodamine123的荧光强度与线粒体膜电位正正比，左侧门控外细胞数作为不正常的细胞数。正常状态下神经细胞荧光值多(即正常膜电位时的细胞线粒体荧光值) 在 30.94±1.87 ,左侧门控外细胞总数为 173 ±26 个。低糖低氧处理 3 h 后,神经细胞的荧光值降至 22.48 ±2.30,左侧门控外细胞总数增加至228±24 个 ,与正常组相比有显著性差异( P <0.01) 。在低糖低氧的同时加入dl-NBP处理,对细胞荧光值和左侧门控外细胞总数产生明显作用，使其基本恢复至正常水平。该研究者后期的研究显示[16]，加入不同浓度的dl-NBP均可不同程度的减轻低糖低氧造成的线粒体膜电位的降低。说明dl-NBP能够改善线粒体功能。

5． 对线粒体能量泵的影响

5.1 动物模型

在脑缺血或低糖低氧状态下，神经细胞内的ATP逐渐耗竭，依靠ATP转运的离子泵像钠泵、钙泵等活性受抑，导致细胞内Na+和Ca2+超载，从而激活一系列的蛋白水解酶，引起迟发性神经细胞损伤甚至死亡。董高翔等[6]通过对MCAO-再灌注模型的研究，发现大鼠大脑中动脉阻断后，皮质神经细胞线粒体ATP酶活性显著降低，而缺血前10min腹腔注射dl-NBP能够使降低的酶活性得到不同程度的恢复。dl-NBP对缺血后脑线粒体ATP酶活性的恢复，可以保证线粒体的正常氧化和产能功能，推迟或防止脑缺血造成的迟发性神经元损伤。高钟生等[15]对慢性脑低灌注状态下大鼠前脑线粒体ATP酶活性的研究中发现，给予丁苯酞注射液后，线粒体ATP酶的活性亦得到显著提高。

5.2 细胞培养

熊杰等[14]对原代培养的胎鼠神经细胞进行低糖低氧处理，用无机磷法测定总ATPase活性，并观察加入dl-NBP后对其活性的影响。研究发现，低糖低氧处理6h后，神经细胞ATPase活性显著降低；在低糖低氧同时加入dl-NBP能够使该酶活性得到明显提高，甚至恢复到正常水平。

6． 其他
  缺血再灌注期氧自由基的增加，是造成神经元迟发性损伤的重要因素[19]。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione
peroxidase,GSH-Px）是体内自由基平衡的酶性调节剂，可以激***内的内源性抗氧化系统，增加自由基的清除,减轻自由基损伤。丙二醛（MDA）是脂质氧化的终产物，其含量的高低可以反应脂质过氧化损伤的程度。董高翔等[6]通过对MCAO-再灌注模型的研究发现，缺血再灌注后大鼠脑线粒体内SOD和GSP-Px的活性均显著降低，而丙二醛（MDA）的含量则明显升高。而给予dl-NBP腹腔注射组，缺血侧脑线粒体SOD和GSH-Px的活性明显升高，MDA的含量明显降低（p<0.05）。种兆忠[20]等通过MCAO-再灌注模型，得出dl-NBP可以显著降低MDA的含量，抑制脂质过氧化。研究说明，dl-NBP可以明显增加自由基的清除，减轻脂质过氧化，减轻缺血造成的迟发性神经元损伤。

dl-NBP 来源于天然植物，对缺血性脑卒中所致脑损伤的多个病理环节都有阻断作用，仅在线粒体保护方面就有多个治疗途径，有较强的抗脑缺血和脑保护作用，减轻脑缺血损伤，降低病残程度。与其他抗缺血性脑卒中药物相比，其治疗靶点多，疗效可靠，安全性好，副反应低，是治疗轻、中度缺血性脑卒中的理想药物。

参考文献 略