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[摘要]目的:考察清痹颗粒对大鼠Ⅱ型胶原性关节炎(CIA) 相关免疫学指标的影响。方法:用Ⅱ型胶原(CⅡ)加完全佛氏佐剂(CFA)免疫Wistar大鼠建立胶原诱导性关节炎(CIA)模型,给药后,检测血清中CⅡ抗体、TNF-α,组织中IL-2水平,脾细胞中TNF-α。结果:清痹颗粒显著降低关节周围组织的白介素-2水平,显著降低模型大鼠Ⅱ型胶原蛋白抗体水平,降低模型大鼠肿瘤坏死因子水平,清痹颗粒对风湿性关节炎有较好的治疗作用。
[关键词]清痹颗粒;Ⅱ型胶原蛋白;类风湿性关节炎
Effect of QingBi-particles on Wistar rats arthritis model induced by the Ⅱ-type collagen protein
Liu Xu-li
(Combination Speciality of Medicine, Grade 2003, 20033017)
[Abstract]Objective: Studying the effect of Qing Bi-particles on related index of immunology in Ⅱ-type CIA wistar-rats. Methods: Wistar rats CIA model was induced by the combination of Ⅱ-type collagen protein and CFA. After administration, test the levels of Ⅱ-type collagen protein antibody and TNF-αof blood-serum, IL-2 of tissues, TNF-α of splenic cells. Results: The IL-2 level of arthrosis circum-tissues was decreased significantly,the level of Ⅱ-type collagen protein antibody was was also decreased significantly as the above. And the tumor necrosis factor level of the handled rats was decreased by QingBi-particles. So, there was a better effect of QingBi-particles on rheumarthritis.
[Key words]Qing Bi-particles; Ⅱ-type collagen protein; rheumatoid arthritis
类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)是一种慢性关节疾病,主要症状是引起关节破坏,导致关节功能受损最终出现关节废用,大量的细胞因子和炎性介质,参与RA的致病过程。RA是一种自身免疫性疾病, 以关节和滑膜的炎症及软骨和骨的进行性破坏为特征[1]。RA的发病在我国约为 0.3%~0.45% ,全世界约为 0.5%~1.0%。其病因及发病机制仍不清楚,研究发现细胞因子在 RA发病机制起重要作用。 活动性类风湿关节炎患者血清白细胞介素-1、肿瘤坏死因子α、白细胞介素-2都有明显的变化[2]。本试验采用的是用Ⅱ型胶原(CⅡ)加完全佛氏佐剂(CFA)免疫Wistar大鼠建立胶原诱导性关节炎(CIA)模型[4]。本文旨在探讨清痹颗粒对Ⅱ型胶原蛋白关节炎模型大鼠相关免疫学指标的影响,为其应用提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物
雄性SPF级 Wistar大鼠80只(130-150g),购于山东大学实验动物中心; 动物生产许可证号:SCXK(鲁)2003004。
1.1.2 药品与试剂
清痹颗粒,山东中医药大学制备批号:20070505,人临床剂量为0.373g生药•kg-1•d-1;火把花根片,重庆市中药研究院制药厂出品,批号:22040610k,人临床剂量为0.045g•kg-1•d-1。
Ⅱ型胶原蛋白,Sigma公司生产,批号:012k7043;完全福氏佐剂,Sigma公司生产,批号:013K4106;大鼠IL-2 Elisa 试剂盒,Biosource International Inc.生产,批号:P031904C;Ⅱ型胶原蛋白抗体Elisa 试剂盒,Chondrex Inc.生产,批号:110304;肿瘤坏死因子(TNF-α)放免试剂盒,[根据相关法规进行屏蔽]总医院科技开发中心放免所提供,批号:2008.05.10。
1.2 方法
Ⅱ型胶原蛋白用0.1M醋酸溶液溶解(2mg•ml-1,4℃过夜),将等量福氏佐剂与Ⅱ型胶原蛋白研磨混匀后,于大鼠尾根部多点注射[5],0.1ml/只(0.2mg)。另取8只大鼠不做处理,作为空白对照组[6]。
造模及空白大鼠常规饲养一周后,在造模的80只大鼠中根据关节肿胀情况,挑选40只关节炎大鼠,根据体重及关节肿胀计分,随机分为5组,每组8只。各组大鼠分别灌胃,分组及灌胃剂量分别为:第一组空白组;第二组模型组;灌胃等体积水(2ml•200g-1);第三组清痹颗粒大剂量组,给药剂量为3.73g生药•kg-1(为人临床剂量的10倍);第四组清痹颗粒中剂量组,给药剂量为1.865g生药•kg-1(为人临床剂量的5倍);第五组清痹颗粒小剂量组,给药剂量为0.933g生药•kg-1(为人临床剂量的2.5倍);第六组火把花根片组,给药剂量为0.1125g•kg-1(为人临床剂量的2.5倍)。
每天给药一次,给药第二周后,五组造模大鼠同上法再次造模一次,0.1ml/只(0.1mg)。各组大鼠共灌胃5周,每周称体重,并观察大鼠关节肿胀情况,记录关节炎评分:0分,无关节肿胀;1分,有红色斑点后轻度肿胀;2分,关节部位中度肿胀;3分,关节严重肿胀; 4分,关节严重肿胀且不能负重;5分,关节肿胀且变形。
大鼠末次灌胃后,禁食不禁水15h,下腔静脉取血,4℃离心,取血清-20℃冷藏,待测CⅡ抗体水平及肿瘤坏死因子(TNF-α);称取脾脏0.3g,用含10%无水乙醇的生理盐水匀浆,4℃离心取上清液-20℃冷藏,待测肿瘤坏死因子(TNF-α);取大鼠关节组织0.1g10%生理盐水匀浆,4℃离心取上清液-20℃冷藏,待测白细胞介素-2(IL-2)。取大鼠踝关节,甲醛固定,HE染色作病理切片,根据炎症、侵蚀及血管翳形成和关节僵直情况的不同进行分级观察:0级(计0分),关节表面软骨光滑,滑膜细胞为单细胞,无炎细胞浸润;1级(计1分),滑膜细胞增生,单核细胞浸润;2级(计2分),滑膜细胞增生,单核细胞浸润,血管翳伸入关节腔面;3级(计3分),炎症进一步发展,关节软骨下骨组织被破坏关节腔单核细胞浸润,腔面完全破坏;4级(计4分),关节腔完全消失、纤维化,使关节僵直。各组结果进行t-检验。
2 结果
由表1可知,模型组与空白组比较,体重增长缓慢,清痹颗粒中剂量组与模型组比较,能显著增加造模大鼠的体重。
由表2可知:与模型组相比较,药后四周时,清痹颗粒中剂量组能显著抑制模型大鼠的关节肿胀,药后五周时,清痹颗粒大、中、小剂量组都能显著抑制模型大鼠的关节肿胀[7]。
表1 清痹颗粒对Ⅱ型胶原蛋白关节炎模型大鼠体重的影响 n=8
分组 剂量g•kg-1 给药前g 药后一周 药后两周 药后三周 药后四周 药后五周
空白组 等体积水 145.4±
11.1 193.0±
13.4 272.0±
16** 290.8±
13.9 322.8±
12.0** 338.8±
12.3
模型组 等体积水 144.5±11.2 195.0±10.1 233.5±22.6## 272.0±31.9 282.0±33.8# 299.4±35.7#
双藤清痹大剂量组 3.73 144.5±10.8 193.5±15.4 243.1±34.3 256.4±39.7# 269.9±36.0## 296.8±45.7#
双藤清痹中剂量组 1.865 149.5±12.1 202.1±16.2 279.6±19.8** 292.8±17.2 325.8±17.9** 349.6±26.0*
双藤清痹小剂量组 0.933 141.1±
9.8 196.6±
13.3 257.3±
19.5* 271.4±
19.4# 300.3±
22.6# 319.9±
25.6
阳性药组 0.1125 142.6±8.8 196.1±13.3 255.1±
28.3 281.1±
31.1 285.5±
37.4# 311.9±
38.6
注:与模型组比较:*p<0.05,**p<0.01; 与空白组比较:#p<0.05,##p<0.01。
由表3可知,清痹颗粒中、小剂量组能显著抑制关节表面及关节腔内的炎细胞浸润,显著抑制关节表面的滑膜细胞增生,对Ⅱ型胶原蛋白关节炎模型大鼠踝关节组织病理学改变有显著改善作用。
由表4可知,与模型组比较,清痹颗粒中剂量组能显著降低Ⅱ型胶原蛋白关节炎模型大鼠关节周围组织的白细胞介素-2水平,中、小剂量组能显著降低模型大鼠Ⅱ型胶原蛋白抗体水平[8-10]。
表2 清痹颗粒对Ⅱ型胶原蛋白关节炎模型大鼠关节炎症的影响 n=8
分组 剂量g•kg-1 给药前 药后一周 药后两周 药后三周 药后四周 药后五周
模型组 等体积水 0.75±0.88 1.75±1.49 2.38±1.92 2.38±1.92 2.63±1.85 2.50±1.77
双藤清痹大剂量组 3.73 0.88±0.83 1.13±1.13 1.88±1.46 2.00±1.51 1.38±1.06 0.88±0.83*
双藤清痹中剂量组 1.865 0.63±0.74 0.63±0.74 1.13±1.13 1.25±1.65 0.88±0.83* 0.63±0.74*
双藤清痹小剂量组 0.933 0.88±0.83 0.88±0.83 1.63±1.06 1.75±1.04 1.5±0.93 0.88±0.83*
阳性药组 0.1125 0.75±0.71 0.75±0.89 1.38±1.06 1.63±1.19 1.25±1.04 0.75±0.71*
注:与模型组比较:*p<0.05,**p<0.01。
表3 清痹颗粒对Ⅱ型胶原蛋白关节炎模型大鼠关节组织学影响 n=8
分组 剂量g•kg-1 关节表面 滑膜细胞 炎细胞浸润 关节腔 病理分级分数
空白组 等体积水 光滑 单层 无 完整
模型组 等体积水 可见腔面完全破坏 大量细胞绒毛状增生 大量 可见纤维化 2.63±0.74
双藤清痹大剂量组 3.73 粗糙,有脱落 多层细胞绒毛状增生 稀疏散在 较完整 1.88±0.83
双藤清痹中剂量组 1.865 较光滑,偶有脱落 可见绒毛状增生 较少见 完整 1.38±0.74*
双藤清痹小剂量组 0.933 粗糙 绒毛状增生 稀疏散在 完整 1.63±0.74*
阳性药组 0.1125 粗糙 绒毛状增生 稀疏散在 完整 1.5±0.76*
注: 与模型组比较:*p<0.05,**p<0.01。
由表5可知,与模型组比较,清痹颗粒大、中、小剂量组能显著降低Ⅱ型胶原蛋白关节炎模型大鼠脾细胞肿瘤坏死因子水平,中剂量组能显著降低模型大鼠血清中的肿瘤坏死因子水平[12,13]。
表4 清痹颗粒对Ⅱ型胶原蛋白关节炎模型大鼠IL-2、CⅡ抗体水平的影响 n=8
分组 剂量(g•kg-1) 组织中IL-2水平(pg•ml-1) 血清中CⅡ抗体水平(×103U•ml-1)
空白组 等体积水 125.8±40.1** 2.676±3.220**
模型组 等体积水 207.4±64.1## 71.69±18.66##
双藤清痹大剂量组 3.73 177.3±41.3# 42.60±27.56*##
双藤清痹中剂量组 1.865 144.2±37.9* 34.36±25.49**#
双藤清痹小剂量组 0.933 166.4±37.7 12.99±8.48**##
阳性药组 0.1125 146.2±39.0* 55.01±26.08##
注 与模型组比较:*p<0.05,**p<0.01; 与空白组比较#p<0.05,##p<0.01。
表5 清痹颗粒对Ⅱ型胶原蛋白关节炎模型大鼠肿瘤坏死因子[11](TNF-α)水平的影响 n=8
分组 剂量g•kg-1 脾细胞pg•ml-1 血清pg•ml-1
空白组
模型组
双藤清痹大剂量组
双藤清痹中剂量组
双藤清痹小剂量组
阳性药组 等体积水
等体积水
3.73
1.865
0.933
0.1125 1.52±0.74**
5.71±1.59##
4.37±1.27##
3.06±1.24**##
3.53±1.47*##
3.65±1.16*## 0.40±0.20**
1.52±0.47##
1.32±0.26##
0.92±0.48#*
1.39±0.32##
1.13±0.74#
注: 与模型组比较*p<0.05.**p<0.01, 与空白组比较#p<0.05.##p<0.01
3 结论与讨论
以Ⅱ型胶原蛋白诱导的大鼠模型是一种筛选和研究治疗 RA药物常用的模型之一[14],其继发性反应期是免疫功能紊乱所造成的免疫性炎性反应[15,16]
。试验结果显示造模成功。
TNF2α和IL-2在RA的发病中起着极其关键能导致软骨吸收和骨质破坏作用[17]。本研究显示,清痹颗粒能够显著增加Ⅱ型胶原蛋白关节炎模型大鼠的体重,显著抑制模型大鼠的关节肿胀,对Ⅱ型胶原蛋白关节炎模型大鼠踝关节组织病理学改变有显著改善作用:显著抑制关节表面及关节腔内的炎细胞浸润,抑制关节表面的滑膜细胞增生;清痹颗粒显著降低关节周围组织的IL-2水平,显著降低模型大鼠Ⅱ型胶原蛋白抗体水平[18],降低Ⅱ型胶原蛋白关节炎模型大鼠肿瘤坏死因子水平,从而有效抑制免疫性炎症反应的发生,治疗风湿性关节炎。
RA是一种难治愈性疾病 ,其病因病机尚不十分清楚。西药只是针对症状的局部用药 ,并且副作用较大 ,价格昂贵 ,不适宜长期服用。中医药治疗 RA注重整体调节 ,辨证分型。近年关于中医药治疗 RA 的实验研究,已初步揭示了中医药对RA的治疗是多途径、 多机制的综合效果,这和中医整体观念的精神一致;对于机理的研究逐渐向细胞、分子水平延深,显示了中医治疗 RA 的优势和潜力。但在复方研究中自拟方较多,治法选方有很大的不确定性,故缺少可重复性[19]。 某些实验研究缺乏严密的科学设计,造模形式多样(尤其抗炎镇痛实验)且无统一的客观标准,今后的研究应着重加强和改进这方面的工作[20]。
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