清痹颗粒对Ⅱ型胶元蛋白诱导大鼠关节炎模型的影响

l****7

[摘要]目的：考察清痹颗粒对大鼠Ⅱ型胶原性关节炎(CIA) 相关免疫学指标的影响。方法：用Ⅱ型胶原(CⅡ)加完全佛氏佐剂(CFA)免疫Wistar大鼠建立胶原诱导性关节炎(CIA)模型，给药后，检测血清中CⅡ抗体、TNF-α，组织中IL-2水平，脾细胞中TNF-α。结果：清痹颗粒显著降低关节周围组织的白介素-2水平，显著降低模型大鼠Ⅱ型胶原蛋白抗体水平，降低模型大鼠肿瘤坏死因子水平，清痹颗粒对风湿性关节炎有较好的治疗作用。
[关键词]清痹颗粒；Ⅱ型胶原蛋白；类风湿性关节炎
Effect of QingBi-particles on Wistar rats arthritis model induced by the Ⅱ-type collagen protein
Liu Xu-li
(Combination Speciality of Medicine, Grade 2003, 20033017)
[Abstract]Objective: Studying the effect of Qing Bi-particles on related index of immunology in Ⅱ-type CIA wistar-rats. Methods: Wistar rats CIA model was induced by the combination of Ⅱ-type collagen protein and CFA. After administration, test the levels of Ⅱ-type collagen protein antibody and TNF-αof blood-serum, IL-2 of tissues, TNF-α of splenic cells. Results: The IL-2 level of arthrosis circum-tissues was decreased  significantly，the level of Ⅱ-type collagen protein antibody was was also decreased significantly as the above. And the tumor necrosis factor level of the handled rats was decreased by QingBi-particles. So, there was a better effect of QingBi-particles on rheumarthritis.
[Key words]Qing Bi-particles; Ⅱ-type collagen protein; rheumatoid arthritis

类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是一种慢性关节疾病，主要症状是引起关节破坏，导致关节功能受损最终出现关节废用，大量的细胞因子和炎性介质，参与RA的致病过程。RA是一种自身免疫性疾病, 以关节和滑膜的炎症及软骨和骨的进行性破坏为特征[1]。RA的发病在我国约为 0.3%～0.45% ,全世界约为 0.5%～1.0%。其病因及发病机制仍不清楚,研究发现细胞因子在 RA发病机制起重要作用。 活动性类风湿关节炎患者血清白细胞介素-1、肿瘤坏死因子α、白细胞介素-2都有明显的变化[2]。本试验采用的是用Ⅱ型胶原(CⅡ)加完全佛氏佐剂(CFA)免疫Wistar大鼠建立胶原诱导性关节炎(CIA)模型[４]。本文旨在探讨清痹颗粒对Ⅱ型胶原蛋白关节炎模型大鼠相关免疫学指标的影响，为其应用提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物
    雄性SPF级 Wistar大鼠80只（130-150g），购于山东大学实验动物中心；   动物生产许可证号：SCXK(鲁)2003004。
1.1.2 药品与试剂
清痹颗粒，山东中医药大学制备批号：20070505，人临床剂量为0.373g生药•kg-1•d-1；火把花根片，重庆市中药研究院制药厂出品,批号：22040610k，人临床剂量为0.045g•kg-1•d-1。
Ⅱ型胶原蛋白，Sigma公司生产，批号：012k7043；完全福氏佐剂，Sigma公司生产，批号：013K4106；大鼠IL-2 Elisa 试剂盒，Biosource International Inc.生产，批号：P031904C；Ⅱ型胶原蛋白抗体Elisa 试剂盒,Chondrex Inc.生产，批号：110304；肿瘤坏死因子（TNF-α）放免试剂盒，[根据相关法规进行屏蔽]总医院科技开发中心放免所提供，批号：2008.05.10。
1.2 方法
Ⅱ型胶原蛋白用0.1M醋酸溶液溶解（2mg•ml-1，4℃过夜），将等量福氏佐剂与Ⅱ型胶原蛋白研磨混匀后，于大鼠尾根部多点注射[5]，0.1ml/只（0.2mg）。另取8只大鼠不做处理，作为空白对照组[6]。
造模及空白大鼠常规饲养一周后，在造模的80只大鼠中根据关节肿胀情况，挑选40只关节炎大鼠，根据体重及关节肿胀计分，随机分为5组，每组8只。各组大鼠分别灌胃，分组及灌胃剂量分别为：第一组空白组；第二组模型组；灌胃等体积水（2ml•200g-1）；第三组清痹颗粒大剂量组，给药剂量为3.73g生药•kg-1（为人临床剂量的10倍）；第四组清痹颗粒中剂量组，给药剂量为1.865g生药•kg-1（为人临床剂量的5倍）；第五组清痹颗粒小剂量组，给药剂量为0.933g生药•kg-1（为人临床剂量的2.5倍）；第六组火把花根片组，给药剂量为0.1125g•kg-1（为人临床剂量的2.5倍）。
每天给药一次，给药第二周后，五组造模大鼠同上法再次造模一次，0.1ml/只（0.1mg）。各组大鼠共灌胃5周，每周称体重，并观察大鼠关节肿胀情况，记录关节炎评分：0分，无关节肿胀；1分，有红色斑点后轻度肿胀；2分，关节部位中度肿胀；3分，关节严重肿胀； 4分，关节严重肿胀且不能负重；5分，关节肿胀且变形。
大鼠末次灌胃后，禁食不禁水15h，下腔静脉取血，4℃离心，取血清-20℃冷藏，待测CⅡ抗体水平及肿瘤坏死因子（TNF-α）；称取脾脏0.3g，用含10%无水乙醇的生理盐水匀浆，4℃离心取上清液-20℃冷藏，待测肿瘤坏死因子（TNF-α）；取大鼠关节组织0.1g10%生理盐水匀浆，4℃离心取上清液-20℃冷藏，待测白细胞介素-2（IL-2）。取大鼠踝关节，甲醛固定，HE染色作病理切片，根据炎症、侵蚀及血管翳形成和关节僵直情况的不同进行分级观察：0级（计0分），关节表面软骨光滑，滑膜细胞为单细胞，无炎细胞浸润；1级（计1分），滑膜细胞增生，单核细胞浸润；2级（计2分），滑膜细胞增生，单核细胞浸润，血管翳伸入关节腔面；3级（计3分），炎症进一步发展，关节软骨下骨组织被破坏关节腔单核细胞浸润，腔面完全破坏；4级（计4分），关节腔完全消失、纤维化，使关节僵直。各组结果进行t-检验。
2 结果
由表1可知，模型组与空白组比较，体重增长缓慢，清痹颗粒中剂量组与模型组比较，能显著增加造模大鼠的体重。
由表2可知：与模型组相比较，药后四周时，清痹颗粒中剂量组能显著抑制模型大鼠的关节肿胀，药后五周时，清痹颗粒大、中、小剂量组都能显著抑制模型大鼠的关节肿胀[7]。

表1 清痹颗粒对Ⅱ型胶原蛋白关节炎模型大鼠体重的影响   n=8
分组        剂量g•kg-1        给药前g        药后一周        药后两周        药后三周        药后四周        药后五周
空白组        等体积水        145.4±
11.1        193.0±
13.4        272.0±
16**        290.8±
13.9        322.8±
12.0**        338.8±
12.3
模型组        等体积水        144.5±11.2        195.0±10.1        233.5±22.6##        272.0±31.9        282.0±33.8#        299.4±35.7#
双藤清痹大剂量组        3.73        144.5±10.8        193.5±15.4        243.1±34.3        256.4±39.7#        269.9±36.0##        296.8±45.7#
双藤清痹中剂量组        1.865        149.5±12.1        202.1±16.2        279.6±19.8**        292.8±17.2        325.8±17.9**        349.6±26.0*
双藤清痹小剂量组        0.933        141.1±
9.8        196.6±
13.3        257.3±
19.5*        271.4±
19.4#        300.3±
22.6#        319.9±
25.6
阳性药组        0.1125        142.6±8.8        196.1±13.3        255.1±
28.3        281.1±
31.1        285.5±
37.4#        311.9±
38.6
注：与模型组比较：*p<0.05，**p<0.01； 与空白组比较：#p<0.05，##p<0.01。

由表3可知，清痹颗粒中、小剂量组能显著抑制关节表面及关节腔内的炎细胞浸润，显著抑制关节表面的滑膜细胞增生，对Ⅱ型胶原蛋白关节炎模型大鼠踝关节组织病理学改变有显著改善作用。
由表4可知，与模型组比较，清痹颗粒中剂量组能显著降低Ⅱ型胶原蛋白关节炎模型大鼠关节周围组织的白细胞介素-2水平，中、小剂量组能显著降低模型大鼠Ⅱ型胶原蛋白抗体水平[8-10]。

表2 清痹颗粒对Ⅱ型胶原蛋白关节炎模型大鼠关节炎症的影响  n=8
分组        剂量g•kg-1        给药前        药后一周        药后两周        药后三周        药后四周        药后五周
模型组        等体积水        0.75±0.88        1.75±1.49        2.38±1.92        2.38±1.92        2.63±1.85        2.50±1.77
双藤清痹大剂量组        3.73        0.88±0.83        1.13±1.13        1.88±1.46        2.00±1.51        1.38±1.06        0.88±0.83*
双藤清痹中剂量组        1.865        0.63±0.74        0.63±0.74        1.13±1.13        1.25±1.65        0.88±0.83*        0.63±0.74*
双藤清痹小剂量组        0.933        0.88±0.83        0.88±0.83        1.63±1.06        1.75±1.04        1.5±0.93        0.88±0.83*
阳性药组        0.1125        0.75±0.71        0.75±0.89        1.38±1.06        1.63±1.19        1.25±1.04        0.75±0.71*
注：与模型组比较:*p<0.05,**p<0.01。

表3 清痹颗粒对Ⅱ型胶原蛋白关节炎模型大鼠关节组织学影响 n=8
分组        剂量g•kg-1        关节表面        滑膜细胞        炎细胞浸润        关节腔        病理分级分数
空白组        等体积水        光滑        单层        无        完整       
模型组        等体积水        可见腔面完全破坏        大量细胞绒毛状增生        大量        可见纤维化        2.63±0.74
双藤清痹大剂量组        3.73        粗糙，有脱落        多层细胞绒毛状增生        稀疏散在        较完整        1.88±0.83
双藤清痹中剂量组        1.865        较光滑，偶有脱落        可见绒毛状增生        较少见        完整        1.38±0.74*
双藤清痹小剂量组        0.933        粗糙        绒毛状增生        稀疏散在        完整        1.63±0.74*
阳性药组        0.1125        粗糙        绒毛状增生        稀疏散在        完整        1.5±0.76*
注: 与模型组比较：*p<0.05，**p<0.01。

由表5可知，与模型组比较，清痹颗粒大、中、小剂量组能显著降低Ⅱ型胶原蛋白关节炎模型大鼠脾细胞肿瘤坏死因子水平，中剂量组能显著降低模型大鼠血清中的肿瘤坏死因子水平[12，13]。

  表4  清痹颗粒对Ⅱ型胶原蛋白关节炎模型大鼠IL-2、CⅡ抗体水平的影响  n=8
分组        剂量(g•kg-1)        组织中IL-2水平(pg•ml-1)        血清中CⅡ抗体水平(×103U•ml-1)
空白组        等体积水        125.8±40.1**        2.676±3.220**
模型组        等体积水        207.4±64.1##        71.69±18.66##
双藤清痹大剂量组        3.73        177.3±41.3#        42.60±27.56*##
双藤清痹中剂量组        1.865        144.2±37.9*        34.36±25.49**#
双藤清痹小剂量组        0.933        166.4±37.7        12.99±8.48**##
阳性药组        0.1125        146.2±39.0*        55.01±26.08##
注 与模型组比较：*p<0.05，**p<0.01； 与空白组比较#p<0.05，##p<0.01。

表5  清痹颗粒对Ⅱ型胶原蛋白关节炎模型大鼠肿瘤坏死因子[11]（TNF-α）水平的影响  n=8
分组        剂量g•kg-1        脾细胞pg•ml-1        血清pg•ml-1
空白组
模型组
双藤清痹大剂量组
双藤清痹中剂量组
双藤清痹小剂量组
阳性药组        等体积水
等体积水
3.73
1.865
0.933
0.1125        1.52±0.74**
5.71±1.59##
4.37±1.27##
3.06±1.24**##
3.53±1.47*##
3.65±1.16*##        0.40±0.20**
1.52±0.47##
1.32±0.26##
0.92±0.48#*
1.39±0.32##
1.13±0.74#
注: 与模型组比较*p<0.05.**p<0.01, 与空白组比较#p<0.05.##p<0.01

3 结论与讨论
    以Ⅱ型胶原蛋白诱导的大鼠模型是一种筛选和研究治疗 RA药物常用的模型之一[14],其继发性反应期是免疫功能紊乱所造成的免疫性炎性反应[15，16]
。试验结果显示造模成功。
    TNF2α和IL-2在RA的发病中起着极其关键能导致软骨吸收和骨质破坏作用[17]。本研究显示，清痹颗粒能够显著增加Ⅱ型胶原蛋白关节炎模型大鼠的体重，显著抑制模型大鼠的关节肿胀，对Ⅱ型胶原蛋白关节炎模型大鼠踝关节组织病理学改变有显著改善作用：显著抑制关节表面及关节腔内的炎细胞浸润，抑制关节表面的滑膜细胞增生；清痹颗粒显著降低关节周围组织的IL-2水平，显著降低模型大鼠Ⅱ型胶原蛋白抗体水平[18]，降低Ⅱ型胶原蛋白关节炎模型大鼠肿瘤坏死因子水平，从而有效抑制免疫性炎症反应的发生，治疗风湿性关节炎。
RA是一种难治愈性疾病 ,其病因病机尚不十分清楚。西药只是针对症状的局部用药 ,并且副作用较大 ,价格昂贵 ,不适宜长期服用。中医药治疗 RA注重整体调节 ,辨证分型。近年关于中医药治疗 RA 的实验研究,已初步揭示了中医药对RA的治疗是多途径、 多机制的综合效果,这和中医整体观念的精神一致；对于机理的研究逐渐向细胞、分子水平延深,显示了中医治疗 RA 的优势和潜力。但在复方研究中自拟方较多,治法选方有很大的不确定性,故缺少可重复性[19]。 某些实验研究缺乏严密的科学设计,造模形式多样(尤其抗炎镇痛实验)且无统一的客观标准,今后的研究应着重加强和改进这方面的工作[20]。











参考文献
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j****r

谁搞的？
晋主任医师完全可以！

l****7

我自己的...是我本科的课题,苦于没积分,斑竹也不给我点积分,,,,,,,,,,,,

j****r

不错，我要是版主会给分的。
这里不是医院，不搞课题研究，一般人对这些不感兴趣。
这里人多数是捞干货的！:lol:

l****7

谢谢叔叔，不知道您年龄也许是哥哥吧。。。。你的分数那么高，怎么弄的啊，我现在很多东西看不了 还望指点下 谢谢了