肺癌基础研究的几个热点

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北京市结核病胸部肿瘤研究所 赖百塘 日期：2004-2-12
    肺癌是严重危害人类生命健康的疾病，在发达国家和我国大城市肺癌已占恶性肿瘤死亡的首位。以北京为例，10年间肺癌病死率快速增长，男性增长26.85%，女性增长35.96%。虽然30年来手术方法、化疗及放疗不断进步，但肺癌5年生存率仅达到13%，因而人们对肺癌的诊断及生物治疗寄予厚望。目前的研究热点很多，现将我们能有所作为的概述如下。
   
    ◆ 端粒酶在肺癌诊断和治疗中的价值
    端粒（telomere）是真核细胞染色体末端的一个特殊的DNA-蛋白质结构，其DNA由5'-TTAGGG-3'六个碱基的重复序列组成，能稳定和保护染色体，在每次细胞分裂后，该重复序列都要缩短，最终导致细胞的衰老、死亡。端粒酶（telomerase）是一种核糖核酸蛋白酶，能在染色体末端合成端粒序列。端粒酶活性存在于生殖细胞、永生细胞、癌细胞及活化的淋巴细胞中，大多数人原发肿瘤中含有端粒酶活性。有人统计了15种肿瘤的644个标本，端粒酶阳性达545例（85%），而相应的293例正常组织，阳性仅21例（7%）。肿瘤细胞端粒酶阳性可维持足够的端粒长度，使癌细胞获得永生，因而在多种肿瘤中，端粒酶活性已成为人类肿瘤诊断的重要标志，并可能成为肿瘤治疗一个新的靶点。端粒酶的重要性引起了各国学者的关注，至今文献已逾4 200篇，端粒酶在肺癌诊断和治疗中的作用也已成为研究的热点。
    对肺癌手术切除标本的端粒酶活性检测结果表明，肺癌标本端粒酶阳性的多在80%以上。多数肺癌组织具有端粒酶活性，而癌旁正常肺组织端粒酶活性很小，从0～7.7%不等，与肺癌组织有十分显著的差异。不同组织类型肺癌端粒酶活性有所不同。在小细胞肺癌(SCLC)中端粒酶阳性比率最高，达98%～100%，而且活性也最高。测定支气管洗涤液中端粒酶的活性是否有助于肺癌诊断的研究也引起了重视。Yan对胸水中端粒酶活性进行了研究，检测的70例恶性胸水标本中，端粒酶活性阳性者64例，而52例非恶性胸水中，仅3例阳性，认为端粒酶活性检测恶性胸水的敏感性为91.4%，特异性达94.2%，有助于恶性胸水的诊断。由于端粒酶的活性在多数肿瘤中检测到，而且端粒酶活性在维持癌细胞永生化中至关重要，因而以端粒及端粒酶为靶子，探讨治疗肿瘤新途径的研究引起了人们更多关注。我们合成了端粒酶反义DNA,在体外及裸鼠体内实验中发现其对肺癌细胞的生长有明显的抑制作用。近年研究发现应用RNAi可有效抑制端粒酶基因表达，减低端粒酶活性，或许可能发展为一种新的治疗方法。
   
    ◆ 血管内皮生长因子与肺癌
    血管内皮生长因子（VEGF）与肺癌的血管形成、癌细胞增殖、转移及预后关系密切，近年成为研究的热点。对多种肿瘤的研究已表明，有VEGFmRNA高表达的病人5年存活率低，认为多种组织类型的肿瘤细胞分泌VEGF，通过旁泌生长**来引发内皮细胞增殖及血管形成，使得肿瘤进展。近年来对血清内及肿瘤内VEGF表达水平与肺癌的关系研究很多，多项研究资料表明，血清内VEGF含量与肺癌预后的关系尚无定论，而对肿瘤内VEGF表达与肺癌关系的1996年以来的13项研究，总计1 271例肺癌病例结果表明，肺癌内VEGF表达与肺癌预后明显相关，VEGF表达高者，生存期短，预后差，认为癌内VEGF表达是肺癌预后的一个重要指标。
    肺癌的手术治疗不断进步，已经可以对多发性肺转移及双侧肺转移性肺癌进行手术，但是一些病例很快发生术后二次肺癌。经检测发现，术后血管形成抑制机制减弱，血清中VEGF增加，加速了微转移灶的发生和发展，使术后迅速出现二次肺癌，由此可知VEGF在肺癌发生发展中起重要作用。我所对191例肺癌及对照者的检测表明，血清VEGF水平与病变侵袭程度、淋巴结转移、远处转移、生存时间密切相关。肺癌病理标本VEGF+者3年存活率39.5%，VEGF-者3年存活率为72%。提示VEGF可作为肺癌者预后判断的重要指标之一。
    VEGF在促进肺癌血管形成中起了重要作用，许多研究表明肺癌中表达VEGF的在50%以上，而且表达VEGF的肺癌病人易出现转移、复发，预后差，因而针对VEGF治疗肺癌是一个十分合理的靶向治疗。近年用VEGF靶向治疗肺癌的研究有如下几个方法。
    ● 直接抑制VEGF的药物
    FR118487是一种血管生成抑制剂，它可在体外抑制VEGF介导的内皮细胞增殖，但并不影响VEGFmRNA的表达，将FR118487注射到荷瘤小鼠腹腔后发现：①原发瘤生长抑制;②肿瘤内血管形成显著减少;③几乎完全抑制了肺及淋巴结的转移。认为FR118487通过抑制VEGF功能而抑制了肿瘤的生长及转移。
    ● VEGF——毒素复合物治疗肿瘤
    制备VEGF与白喉毒素复合物，将复合物注射于荷瘤裸小鼠腹腔以治疗肿瘤，并以单独注射白喉毒素者为对照。结果表明，VEGF-白喉毒素复合物显著抑制了移植瘤的生长，肿瘤出现出血性坏死，而正常组织未受影响。认为VEGF-白喉毒素复合物的抗瘤活性是选择性靶向肿瘤的血管形成。
    ● 抗VEGF抗体的作用
    从兔子制备的抗VEGF抗体，经亲和纯化后可得到VEGF中和抗体，该VEGF中和抗体能以剂量依赖方式抑制S-180肉瘤的生长。在每日剂量为200μg/小鼠时，抑制率为41%，对人胃癌（MGC803）裸鼠移植瘤的抑制率为76.2%。将VEGF中和抗体与131I-3H11小鼠单克隆抗体联合后效果更好。5只裸鼠中只有一只生长肿瘤，肺转移数目减少73%，认为VEGF中和抗体可能用于临床癌及转移的治疗。
    近年，Asano等制备了抗VEGF/VPF121免疫中和单克隆抗体MV303，用人脐静脉内皮细胞（HUVEC）实验，发现MV303能抑制VEGF/VPF121及VEGF/VPF165引发的HUVEC细胞增殖，但不能抑制bFGF诱发的增殖。MV303抑制了125I-VEGF/VPF121与HUVEC的结合。用人纤维母细胞系HT-1080的实验表明，静脉注射100μg/小鼠MV303，可抑制HT-1080诱发的血管形成，并且皮下或静脉注射MV303 100μg/小鼠，连续10次，几乎完全抑制了HT-1080裸小鼠移植瘤的生长，甚至从肿瘤接种第8天开始给MV303也能抑制肿瘤生长，注射MV303小鼠寿命显著延长。认为中和单抗MV303抑制了移植瘤及转移瘤的生长而无显著的不良反应。
    Asano等人又制备了一个抗VEGF中和单抗MV833，对包括肺、结肠、乳腺、胰腺、黑色素瘤等的27个癌细胞系进行了实验。体外实验发现，外源性加入MV833并未影响各细胞系的体外增殖，将27个细胞系接种于裸鼠，MV833体内给药显著抑制了各个癌系裸鼠移植瘤的生长，肿瘤体积长到400mm3时再开始给药，也能完全抑制一些瘤系的生长。认为VEGF是很多肿瘤血管形成的关键因子。
    VEGF中和抗体可能发挥广谱抗肿瘤的作用，展示了靶向VEGF治疗肿瘤的美好前景。位于美国加州旧金山的Genetech公司研究人员制备了抗VEGF单克隆抗体，Rhu Mab VEGF正在进行II期临床实验，对多达20余种血管生成抑制剂的研究吸引了人们的关注。有3种合成的基质金属蛋白酶抑制剂Marimastat、Bay12-9566及Ag3340已进入III期临床实验，11种其他制剂，包括抗VEGF单抗已进入II期临床实验，我们相信近年即可得出抗肿瘤进展的疗效报告。
   
    ◆ 抗人肺癌抗体及免疫毒素的研究
    自1975年Kohler和Milstein建立细胞融合的杂交瘤技术以来，各国学者十分重视，迅速建立了几乎包括所有肿瘤的单克隆抗体，在Huberman和Minna相继成功制备了抗人肺癌单抗后，在全世界已制备了上百个抗肺癌的单抗，国内仅北京和上海就已制备了10余个抗肺癌的单抗。可见在20世纪80年代，人们对单抗在肺癌诊断和治疗中的作用产生了极大兴趣，寄予很大期望。但经过几年实践后，认识到鼠源抗体在人体内半衰期为16～48小时，比人IgG的21天短得多，并且鼠单抗在人体内为异性蛋白，易产生抗抗体，如采用Fab或F(ab)′，虽能保留抗原结合部位，但在血清中廓清率更快。而用人骨髓瘤细胞制备人的单抗，技术上又有诸多困难，因而抗肺癌抗体的研究热潮逐渐冷却。
    随着分子生物学技术的迅速发展，用基因工程方法制备及改造抗体日渐成熟，特别是噬菌体抗体库技术自20世纪90年代初问世以来，为抗体的制备开辟了全新的技术领域。基因工程抗体包括:①鼠/人嵌合抗体；②人源化抗体；③小分子抗体；④人源抗体。利用基因工程抗体技术对鼠杂交瘤单克隆抗体进行改造，如ScFv及人源化抗体，是现今抗体制备新型抗体开发的热点。
    美国FDA已批准的重组抗体有治疗非何杰金淋巴瘤的Rituxan及Bexxar，治疗乳腺癌的Herceptin，其消瘦利润迅速增长，抗体与毒素联结制备的免疫毒素在靶向治疗中起到重要作用。毒素包括抗癌药如Adr、PDD、MMC等，及植物毒素如蓖麻蛋白A，细菌毒素如假单胞菌外毒素等。最近收集的近20余篇报告，用免疫毒素治疗肿瘤的600余例。多种肿瘤的I-III期临床实验，显示了基因工程抗体免疫毒素在治疗肿瘤中的巨大潜力，相信不断进步的这一治疗方法将在肺癌诊断与治疗中发挥一定的作用。
    我所制备了鼠抗人肺癌单克隆抗体，并研究了所制备的免疫复合物，这些抗体能很好识别肺癌细胞，其免疫复合物靶向性好，在体外及体内实验中能大大降低抗癌药用量。并已应用蛋白质组学技术鉴定出该抗体所识别的抗原性质。目前，我们对制备的鼠抗人肺癌单抗经基因工程改造，表达抗肺癌单链抗体，并联结ADM制备了ScFv-ADM免疫结合物，体外实验的结果显示免疫结合物对肿瘤细胞的杀伤活性是ADM的4倍。为临床靶向治疗应用奠定基础。
   
    ◆ 蛋白质组学在肺癌研究中的应用
    在后基因组时代，检测一种组织或细胞型的蛋白表达的蛋白质组学补充了基因组学的研究，并且进一步揭示了肺癌的生物医学问题。应用双向电泳，飞行质普技术，探讨高表达的肺癌蛋白、分析和鉴定肺癌抗原、探讨癌变机理。应用蛋白质芯片-飞行质普技术通过差异显示可找出肺癌的标志蛋白。其最大特点是快速、简便、易行、样品用量少，并可进行高通量分析。已有报告基于蛋白质指纹分析能极好地进行肺癌组织类型分类，并准确测定淋巴结转移状况。