【分享】自身抗体概述

江**号

自 身 抗 体 概 述
第一节        自身免疫与自身免疫性疾病
一、自身免疫的概念
自身免疫是指机体免疫系统对自身成分发生免疫应答，产生针对自身成分的抗体和/或致敏的淋巴细胞性免疫效应。自身免疫可以是正常生理性的，例如，针对衰老或死亡的自体细胞，机体产生少量的自身抗体，以便被脾、肝及单核-吞噬细胞系统中的巨噬细胞吞噬，维持机体内环境的生理稳定；自身免疫也可以是病理性的，引起自身疫病。研究发现，大部分自身免疫应答是由外界异物（病原体或化学品等）结合自身成分引起，或是由与自身抗原结构有部分类似或相同的异物抗原单独引起。
二、自身免疫性疾病
在内因与外因的共同作用下，机体的自身免疫应答失控，反应过度，直接或间接破坏自身组织，并引起相应器官病变或临床症状的一类疾病，则为自身免疫病。内因包括遗传易感、免疫耐受性减低或丧失、调节失常、衰老体弱等；外因主要包括感染、物理、化学等因素。
自身免疫病有以下特点：1、多数自身免疫病是自发或特发性的，感染、药物等外因可能有一定的影响；2、患者血清中有高水平的r-球蛋白；3、患者血清中有高效价的自身抗体或出现与自身抗原反应的致敏淋巴细胞；4、病损部位有变性的免疫球蛋白沉积，呈现已大的淋巴细胞和浆细胞浸润为主的慢性炎症；5、病程一般较长，发作与缓解交替出现，仅有少数为自限性；6、女性多与男性，老年多与青少年；7、有遗传倾向；8、应用肾上腺皮质激素等免疫抑制剂有效；9、常有其它自身免疫病同时存在；10、可**出相似的动物疾病模型。
自身免疫病患者中，有相当一部分病人的血清或其它体液中可检测出一种或多种高效价的自身抗体，能为自身免疫病的诊断提供非常有价值的依据。
第二节        自身抗体的分类和命名
一、自身抗体的概念
由各种原因造成的机体B细胞产生针对自身组织成分的抗体，称为自身抗体。自身抗体可以是生理性的，也可能以是病理性的。正常人群中生理性自身抗体的存在相当普遍，其作用之一就是净化体内衰老及死亡的细胞。
如果使用足够敏感的方法，每个人都可检测出一些自身抗体。但通常这种自然产生的生理性自身抗体滴度很低，与相应的抗原亲和力弱，且大多为IgM型。偶尔，没有任何临床症状的人也可检测到具有一定亲和力及高滴度的IgM型抗体，此时应注意观察并作为以后诊断的依据。每一实验室应当建立自己的自身抗体检测阈值，仅当自身抗体的滴度超出此阈值时，才认为有临床意义。
二、自身抗体的分类
自身抗体有多种分类方法。例如，按照自身抗原在体内分布的不同可分为器官/组织特异性自身抗体和非器官/组织特异性自身抗体；按照检测自身抗体所用基质的不同可分为细胞抗体（以游离的细胞为实验基质，例如用HEp-2细胞所检测的抗核抗体）及组织抗体（以动物组织切片为实验基质，例如用心肌所检测的抗心肌抗体）。细胞抗体还可分为细胞非特异性自身抗体（例如抗核抗体等）和细胞持异性自身抗体（如抗中性粒细胞浆抗体、抗红细胞抗体、抗血小板抗体以及抗淋巴细胞抗体等）。另外，还有抗血清成分自身抗体，例如抗凝血物质抗体、类风湿因子等。这些分类方法的侧重点不同，但有着密切的联系。例如，细胞抗体主要为非器官/组织特异性自身抗体，而组织抗体主要为器官/组织特异性自身抗体。
三、自身抗体的命名
自身抗体的命名尚不统一，一种自身抗体，往往有几个名称。例如，抗丝集蛋白抗体就还有以下名称：抗角质蛋白抗体、抗大鼠食管角化层抗体等。自身抗体的命名，有的以抗体在细胞或组织中存的位置进行命名，如抗细胞浆抗体、抗细胞核抗体、抗核仁抗体等；有的以靶细胞或靶组织进行命名，如抗胰岛细胞抗体、抗骨骼肌抗体等；有的以相关疾病进行命名，如抗天疱疮抗体、抗类天疱疮抗体等。
现已抗核抗体为例，介绍一下自身抗体的命名，如下：1、以首先检测到该抗体的患者名字缩写进行命名，如抗Sm、抗Ro、抗La、抗Ma；2、以相关疾病的名字缩写进行命名，如抗Scl-70、抗SS-A、抗SS-B等；3、以抗原的化学性质进行分类命名，如抗DNA、抗RNA等；4、以抗原的部位进行命名，如抗板层素、抗核膜抗体等。作者认为，自身抗体的命名应尽量根据抗体所针对的抗原进行命名。这样一方面可说明抗体的靶抗原，另一方面便于名词的统一。
第三节        自身抗体的检测方法
随着对自身免疫病流行病学的调研和对自身抗体本身的不断研究，目前已知，相当多的自身抗体与某些特定的疾病相关联，有些自身抗体是某种疾病的标志抗体。自身抗体检测已成为诊断自身免疫性疾病的重要工具。下面简要说明目前用于检测自身抗体的主要方法：
一、对流免疫电泳及免疫双扩散法
对流免疫电泳（CIE）及免疫扩散（ID）法均需要在琼脂糖凝胶上进行。首先在铺好的琼脂糖板上打孔，然后按一定顺序加入适量的可溶性抗原以及适当稀释的待测血清。对流免疫电泳法需在电流的作用下（电泳仪）进行，而免疫扩散法在湿盒内放置于室温下反应即可。两者的阳性结果均为在已知抗原与待测血清之间出现沉淀线。
临床免疫实验室在用间接免疫荧光法对自身抗体进行初筛后，针对可溶性核抗原相应的自身抗体，往往采用对流免疫电泳及免疫扩散法进行进一步的确认或鉴定。对流免疫电泳及免疫扩散法均需要较多的抗原。对流免疫电泳法比免疫扩散法快速、灵敏；免疫扩散法不需要特殊设备，但耗时较长、操作不便，加外检测的敏感性也相对较低，主要用于自身抗体的进一步鉴定。
随着ELISA、免疫酶斑点实验及免疫印迹法等商品化试剂盒在自身抗体检测中的应用，对流免疫电泳及免疫扩散法在国内的应用有减少的趋势，而在国外该法仍然很受欢迎。这主要因为对流免疫电泳及免疫扩散法对自身抗体进行检测和鉴定，方法较为稳定，临床符合率高。
二、免疫荧光测定法（IFA）
免疫荧光测定法可分直接免疫荧光法（DIFA）和间接免疫荧光法（IIF）。在自身抗体检测中，以间接免疫荧光法最为常用。该方法敏感、简单且重复性好，如果有一台质量较好的荧光显微镜，几乎所有的实验室都可开展。
间接免疫荧光法的基本操作程序及原理如下：将已稀释的待测血清与实验基质进行温育，如果标本阳性，IgA、IgG和IgM类特异性抗体与实验基质中相应的抗原结合。然后用适当缓冲液洗去未结合物。再根据需要检测的自身抗体Ig类型，选择荧光素标记的相应抗人Ig抗体（IgA、IgG、IgM或IgGAM的混合物）进行第二次温育。此时，已与实验基质中相应抗原结合的人抗体再与荧光素标记的抗人抗体结合。进行冲洗后，滴加甘油缓冲液封片，在荧光显微镜下观察相应部位出现的特异性荧光模式。
三、酶联免疫吸附测定法（ELISA）
由于纯化的或重组抗原越来越多，以及商品化的高质量的酶联免疫吸附测定试剂盒的面市，它应用于临床免疫实验室自身抗全的检测已日渐增多。该方法检测自身抗体快速、敏感及特异性高，但对抗原的要求很高，必须使用高质量的纯化抗原。由于一种抗原只能检测一种抗体，多种抗体的检测就需要多种单独的抗原，因此该法在临床免疫实验室的应用受到一定限制。
酶联免疫吸附测定法检测自身抗体，首先需将纯化的抗原包被在固相载体（酶标板的反应孔）上，与一定稀释度的待检血清反应。然后与酶标记的第二抗体（抗人IgA、IgG、IgM或IgGAM的混合物）反应，其酶可催化色原底物（自然状态下无色，在酶的作用下变为有色产物）最后在酶标测定仪一定波长下进行比色，测定吸光度。
荧光免疫、放射免疫及酶联免疫被称为三大标记技术。
四、免疫印迹法（IB）
免疫印迹也称西方印迹。它是将聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白及多肽与免疫反应的高特异性相结合的一项技术。首先，蛋白在聚丙烯酰胺凝胶电泳中依分子量大小分离，然后将分离好的蛋白转印到硝酸纤维薄膜上。可以用酶或放射性核素标记的抗体或蛋白A进行免疫染色。
五、酶免疫斑点（条带）实验-EUROASSAYTM技术
   该法是最近兴起的特异性检测抗体（如ENA抗体）的新方法，以EUROIMMUN发明的 EUROASSAY技术为代表，下面作一介绍。
将经亲和层析纯化的抗原分别包被在膜条上，然后将膜条固定在载片反应区。若是阳性标本，已稀释血清中的特异性抗体将与固相上的抗原结合。第二步，碱性磷酸酶标记的抗人抗体与已结合的抗体反应。第三步，加入可产生颜色反应的底物溶液温育。若标本中含有特异性抗体，相应的抗原线将呈现深色的条带。
该法适合临床常规应用，有以下优点：将经亲和层析纯化的抗原包被在固定的位置，每一种抗体只对应一条带，不会产生非特异性反应条带，结果灵敏度高，特异性好，判断实验结果比免疫印迹法简单；每个反应区均有质控带，可以显示操作是否正确；阳性与阴性结果的差别明显，容易判断，条带显色的强度与抗体滴度相关；不需特殊仪器，实验结果用肉眼观察；反应过的载片可长期保存，试验结果易存档。
六、放射性核素法
   尽管放射性核素法不作为首选的方法，但在有些实验中仍然使用此法来检测自身抗体的相对水平。自身抗体的测定可采用直接结合法（即待测标本直接与放射性同位素标记的抗原进行反应），也可使用间接或竞争性测定法。
   抗双链DNA（dsDNA）抗体的测定可使用间接结合测定法。一定稀释度的待测标本（血清）与125I标记dsDNA的进行温育，抗dsDNA抗体与125I dsDNA结合而产生的复合物可被33%--50%的饱和硫酸铵溶液沉淀，沉淀物中放射核素的含量与抗dsDNA抗体的含量成正比。结果以沉淀物中放射性测定值占最初加入125I的放射性测定值的百分率表示。
   抗内因子抗体可用放射性竞争试验来测定。该法是基于放射性标记的维生素B12可被随后加入的活性炭吸附而得以分离的原理。通过比较活性炭中沉积的放射性计数与上清中的放射性计数，可确定抗内因子抗体的量。
七、免疫沉淀法
  该法通常是用放射性核素将细胞（或抗原）进行标记，破坏细胞获得混合抗原，然后与结合了蛋白A（金黄色葡萄球菌蛋白A）的琼脂糖珠的待测标本（血清）进行反应（免疫沉淀）。随后进行凝胶电泳，并将电泳后的凝胶对以X光片进行曝光，与正常及标准品比较而得出结果。
  该法高度敏感和特异，可用于Sm、U1-RNP、SS-A、SSB等的检测，特别是当其它方法的结果不理想时。实验中应用的蛋白A，可以特异性地与许多哺乳动物的IgG亚类的Fc段牢固地结合（但与IgG3、IgM、IgA结合差）。蛋白A一边结合琼脂糖珠，另一边结合抗体的Fc段，因此可以明显放大抗原抗体的沉淀反应。
  该法的缺点为：1、需要使用放射性核素；2、单独使用不能够区分Sm与RNP；3、细胞生长过程中代谢率低或与放射性核素不等结合的蛋白抗原，不能用此法检测。
八、被动凝集试验
1、        乳胶颗粒凝集试验
该试验最常用于类风湿因子的检测。首先用人免疫球蛋白包被乳胶颗粒，然后与一定稀释度的血清进行温育。如果存在IgM型类风湿因子，将在一分钟左右产生肉眼可见的粗大的颗粒凝集。该方法极为简便快速，任何实验室都可开展，但只能半定量IgM型的类风湿因子。
2、        被动血凝试验（PHA）
该法首先将合适浓度的抗原包被羊红细胞，再与不同稀释度的待检血清反应，观察96孔血凝板中血细胞凝集的终点孔，即为被检血清中某自身抗体的滴度。该方法敏感性强，但实验程序繁锁，干扰因素多，只有严格控制每一个步骤，才能获得可靠的结果。