嵌合抗原受体T细胞作为溶瘤病毒载体

殷**8

改造的T细胞在血液恶性肿瘤的过继细胞免疫治疗中显示出了显著疗效。然而，在实体瘤治疗中成功案例较少。溶瘤病毒（OVs）具有特异性裂解肿瘤细胞以及通过破坏血管间接抑制肿瘤生长的能力。这些抗肿瘤能力在全身给药时与淋巴细胞相关，故需要高剂量给药以逃避抗体和免疫系统其他部分的攻击。T细胞可以自由在体内通行，使用这些细胞将OVs直接递送到肿瘤组织可能会是一个很理想的方案。在小鼠和人T细胞中，作者研究表明CAR-T细胞负载低剂量病毒不会影响受体的表达和功能。改造的T细胞可以将病毒富集到多种肿瘤细胞靶标上，以提高联合疗法的抗肿瘤活性。这一方法可以广泛使用，因为作者在感染RNA或DNA病毒的鼠或人T细胞上观察到类似的结果。总而言之，改造的T细胞装载OV可能是一种能提高疗效的新的联合疗法。

前言

溶瘤病毒（OVs）能够选择性感染肿瘤细胞，并在其中**并杀伤肿瘤细胞，而不会伤及健康组织。此外，这些病毒可以诱导强力的免疫应答，增强机体的抗肿瘤反应。已经发现疱疹性口腔炎病毒（VSV）具备这一属性。M蛋白（VSVΔM51）突变增强了这种病毒的干扰素敏感性，同时显著增强了其安全性和肿瘤趋向性。牛痘病毒（VV）已广泛用在临床前模型和临床试验，病毒的全身治疗结果显示是安全的。作者对胸苷激酶和病毒生长因子基因缺失的这种“双重缺失”型重组牛痘病毒很感兴趣。这种病毒肿瘤趋向性增强，并且在静止期细胞内**受限。

关于VV全身给药的临床试验给予高剂量病毒的取值范围在每例患者1×105到3 × 107 PFU/kg。迄今为止临床试验中VSV的使用仍然受限，在动物试验中每只小鼠通常采用高于5 × 108PFU的剂量，表明了人体中使用的剂量也可相当高。据推测静脉给予这么高剂量的病毒是因为多个血源性防御机制会消灭病毒，如补体，抗体，免疫细胞，所以需使用饱和剂量突破防御机制使病毒能转运至肿瘤。

过继细胞治疗（ACT）已成为某些种类的癌症有效的治疗方法，包括黑色素瘤的肿瘤浸润T淋巴细胞治疗和恶性血液肿瘤的改造T细胞治疗。ACT研究的成功证明，T细胞的过继转移使T细胞迁移至肿瘤位点以发挥抗肿瘤作用。有趣的是，OVs发现与外周血淋巴细胞如B细胞有天然的关联。因此在过继细胞治疗前将淋巴细胞负载OVs受到关注。这种方式装载OVs的淋巴细胞可以将OV输送到肿瘤部位。的确，前期的报道显示在转基因小鼠中T细胞可以转运OV到成瘤部位，并且这一组合可以导致肿瘤排斥反应。装载VSV到T细胞中可以保护病毒避免与抗体中和，并保持其抗肿瘤功效。同样，VV可以利用细胞因子诱导的杀伤细胞在肿瘤内有效携带和积蓄，引发再次抗肿瘤效应。在嵌合抗原受体（CARs）改造的T细胞过继输注的临床试验中看到了具有前景的治疗效果，作者感兴趣的是确定是否CAR-T细胞可装载OV并保持抗肿瘤活性，从而有效的构建双重抗肿瘤活性制剂。在这篇文章中，作者证明VSVΔM51和vvDD可以成功地加载到小鼠和人CAR-T细胞，并且不会影响CAR的表达，活力或功能。作者的数据还进一步表明，OV-CAR-T细胞是能够将病毒富集到到肿瘤靶点，并且该组合具有增强两者单一疗效的潜力。这些数据为未来两种治疗的结合应用提供依据。

结果

CAR-T细胞负载OV不影响CAR的表达

首先作者要确定CAR-T细胞负载OV组合的可行性以及研究中使用病毒的感染复数（MOI）。使用逆转录病毒转导CAR-’ve的小鼠T细胞（避免CAR的潜在影响），在MOI值为0.3，1和3负载VSVΔM51-GFP和vvDD-GFP Murine (图1a)。作者预实验发现，VSVΔM51-GFP和 vvDD-GFP负载改造的T细胞在MOI值为3时在肿瘤靶标上的沉积水平最高，以及重复性相对要高（图1a）。在用慢病毒改造的人T细胞测试得出了相同的结果，即在MOI值为3时病毒沉积水平最高（图1b）。基于这些结果，在随后的实验中所有T细胞和病毒使用这一MOI值。

接下来作者测试负载OV是否会对T细胞造成影响。MOI值为3使用VSVΔM51-GFP和vvDD-GFP负载改造的T细胞。在洗涤后，将细胞培养过夜，并进行病毒**，或CAR的表达或功能改变的分析。在这些研究中所用的HER-CAR示意图在附件图S1中。利用流式细胞术检测携有GFP病毒感染的细胞发现感染VSVΔM51-GFP和vvDD-GFP的一小部分小鼠T细胞（图2a,b;附件图S2a）中CD4+CD8+亚群GFP表达水平相近。作者继续研究OV的负载对CAR表达的影响发现负载任一OV后对CAR的表达水平没有影响（图2c，附件图S1B）。