脑肿瘤免疫治疗的一般情况

雅*

脑肿瘤的免疫治疗

肿瘤生物治疗被称为是继手术治疗、放射治疗、化学治疗三大常规疗法后的第四种肿瘤治疗方法，它主要是通过调动机体的天然防卫机制或给予机体某些物质来取得抗肿瘤的效应。肿瘤生物治疗的范围很广，现今尚缺乏完善的定义，中国抗癌学会肿瘤生物治疗专业委员会的表述为：凡采用生物技术手段，达到治疗肿瘤目的者，皆可列入肿瘤生物治疗范畴，主要包括：细胞因子、造血免疫细胞、单克隆抗体、基因导入及疫苗等。其中，免疫治疗与基因治疗及二者相互结合构成了肿瘤生物治疗的主要部分。
近年来，随着人们对抗肿瘤防卫机制的基础理论的深入理解和现代生物技术的迅速发展，肿瘤免疫治疗在基础理论和临床治疗上均取得了较大进展，但总体仍处于实验和临床研究阶段，我国卫计委于1993年批准成立了 “体细胞与基因治疗专业委员会” 负责审批国内生物治疗应用方案。以下简要介绍脑肿瘤相关的免疫学特点和主要免疫治疗方法。
一 脑肿瘤相关免疫学知识
（一）中枢神经系统免疫特点
中枢神经系统（central nervous system,CNS）过去曾长期被认为是一个免疫特免部位（immunological privileged site）。人们起初发现将同种异体抗原移植到实验动物脑组织后并未观察到如同移植于外周组织后的排斥现象，加之中枢神经系统在解剖结构上的特殊性，血脑屏障对外周免疫物质和细胞的阻挡，以及当时认为CNS缺乏固有的抗原提呈细胞，这些看法使人们认为CNS无自身免疫能力，又与外周免疫系统相隔绝而成为无免疫的特殊部位。
这种观点逐渐遭到了质疑，此后的研究相继发现脑对同种异体和异种移植物均可发生排斥现象，而在免疫抑制的动物可以避免，提示中枢神经系统存在免疫反应能力。血脑屏障正常情况下可以阻止淋巴细胞进入中枢神经系统，但在许多病理情况下，淋巴细胞可通过损害的血脑屏障进入中枢神经系统，同时动物实验证明脑脊液与颈淋巴结间存在联系。此外，小胶质细胞在CNS可发挥专职抗原呈递细胞作用也得到确认。 目前认为CNS是一个免疫部分特免部位，总体上细胞免疫较弱而体液免疫正常或增高，多种细胞因子参与了免疫调节。
（二）脑肿瘤免疫学特点
免疫学研究表明机体存在着抗肿瘤应答 ,且主要是特异性Ｔ淋巴细胞免疫应答。肿瘤抗原肽的寻找是此项研究的关键 ,随着Ｔ细胞识别机制的阐明、重组ＤＮＡ技术的发展和癌基因研究的深入 ,在肿瘤抗原肽的获取、表位结构的鉴定以及利用抗原肽进行免疫治疗和免疫接种等方面的研究都取得了一定进展
二 特异性主动免疫治疗
1902年 Leyden和 Blumenthal就首先进行了瘤苗主动特异性免疫治疗 (active specific immunotherapy,ASI)的临床试验。但在随后的半个世纪内 ,用肿瘤细胞或其提取物免疫癌症患者 ,未获肯定的疗效。肿瘤疫苗的发展经历了肿瘤细胞疫苗、重组蛋白疫苗和基因疫苗三个阶段。基因疫苗具有制备容易、生产成本低廉、储存和运输方便、使用方法简单等常规疫苗无法比拟的优点。ＤＮＡ疫苗的另一优势是可将多个抗原表位基因克隆在同一表达载体 ,制备多表位ＤＮＡ疫苗 (多价疫苗 ) ,诱导产生针对多种不同抗原表位的抗肿瘤免疫。与病毒载体相比 ,质粒载体既不会引起抗质粒的免疫反应 ,也没有潜在的致病危险性。质粒ＤＮＡ可长期存在于接种部位的组织细胞内 ,模拟自然感染过程 ,长期表达抗原蛋白 (但不存在减毒活疫苗的毒力回复等危险 ) ,持续**免疫系统 ,能够诱导产生强大而持久的免疫应答。ＤＮＡ疫苗所表达的内源性抗原 ,有利于ＭＨＣ-Ⅰ类分子的抗原呈递 ,有利于诱导CTL而更有效地诱导抗肿瘤免疫反应。
(一) 肿瘤细胞疫苗
肿瘤细胞疫苗是人们最早研究和应用的肿瘤治疗性疫苗。早在本世纪初 ,人们就开始用经照射或病毒感染的肿瘤细胞或其溶破产物作为免疫原研究其对荷瘤机体的治疗效果 ,但由于肿瘤细胞免疫原性弱 ,缓解率很低。Trouillas等采用自体瘤细胞提取物和福氏佐剂为疫苗成分，将65例恶性星形胶质细胞瘤随机分为4组，分别给予放疗、疫苗、放疗加疫苗和支持治疗，28例接受疫苗的患者中有24例出现了迟发性超敏反应，放疗加疫苗组平均生存期为10.1月，而放疗组仅为7.5月。但同期其它自体或异体肿瘤细胞疫苗的胶质瘤治疗实验则多数效果不佳。
最近，Jean等报道对大鼠接种9L细胞疫苗同时通过微型渗透泵皮下给予IL-12后，9L胶质肉瘤生长受到抑制，此后该研究小组又在接种疫苗时通过该法给予GM-CSF，同样观察到颅内和外周的9L胶质肉瘤生长受到抑制。该项研究提示：通过此方法给予细胞因子可达到细胞因子基因修饰疫苗的效果，而无需复杂的基因转染过程，相对于细胞因子基因修饰疫苗更为简便和安全。
（二）基因工程疫苗
随着肿瘤免疫学和分子生物学的发展 ,基因工程技术被引入肿瘤细胞疫苗的研究。人们用逆转录病毒、腺病毒等载体将外源基因导入肿瘤细胞内 ,以提高其免疫效应。转染的外源基因主要为编码细胞因子（如IFN-γ、GM-CSF、和IL-12等），T细胞共**分子（B7-1，B7-2），以及MHC分子的基因。采用上述基因修饰肿瘤细胞疫苗能提高瘤苗的免疫原性或激活效应细胞的功能，从而提高肿瘤疫苗的免疫效率。最近，应用转染GM-CSG或IL-12等基因的自体瘤苗治疗晚期黑色素瘤的计划已进入早期临床试验阶段。
脑肿瘤的转基因疫苗研究仍主要处于动物实验阶段。在鼠源性的GL261胶质瘤动物模型上观察到：给予转染了GM-CSF基因的灭活GL261细胞疫苗可抑制肿瘤的生长并延长动物的生存时间。此外，转染的外源性基因也可针对免疫抑制因子的反义基因，如转染TGF-β2反义基因的大鼠9L胶质肉瘤细胞疫苗可明显抑制颅内相应肿瘤的生长。转染IGF-1或IGF-1受体反义基因的C6胶质瘤细胞疫苗可抑制皮下或颅内相应肿瘤的生长，原因可能是由于IGF-1通路阻断引起MHC与B7分子表达上调所致。转基因肿瘤细胞疫苗应用于脑肿瘤临床治疗仍存在许多问题。从肿瘤细胞的来源来看，自体肿瘤细胞疫苗具有与病人的HLA最匹配、表达的抗原相同等优势，但欲获取每例患者的胶质瘤细胞并予以转染目的基因较困难，转染肿瘤细胞的原代培养现在仍存在许多问题，在以后的筛选过程中也可能发生抗原丢失。即使转染成功的肿瘤细胞也会由于生长缓慢且耗时较长而使患者错过治疗时机。采用同种异体肿瘤疫苗关键问题是要与病人的肿瘤细胞表达相同的肿瘤抗原，且异体肿瘤细胞疫苗易被机体清除。此外，单一细胞因子基因修饰的瘤苗的免疫激活作用有限，将之与其它细胞因子、共**因子、MHC或肿瘤抗原进行联合基因转染是今后的发展方向。
（三）多肽疫苗
多肽疫苗是采用肿瘤抗原的特异性表位诱导特异性的CTL免疫应答以达到抗肿瘤效应，目前认为合成的表位肽在激活免疫系统方面于天然的内源性肽具有着同等的效力，并具有很强的特异性。由于现阶段绝大部分脑肿瘤的特异性抗原表位尚未确定，相应的多肽疫苗研究较少，有报道采用病毒相关肽疫苗对颅内Ｃ3肿瘤动物模型的治疗效果。多肽疫苗的免疫原性较弱，在体内易被肽酶降解，对表位多肽进行修饰或采用多价疫苗可有效提高其免疫原性，而脑肿瘤抗原表位的鉴定是多肽疫苗研制的基础。
（四）肿瘤核酸疫苗
Wolff等于1990年首次报道将编码基因的 DNA质粒直接注射至小鼠肌肉组织内，质粒可被肌细胞摄取并获得了较持久的蛋白表达。随后研究表明，肌肉注射编码抗原的质粒 DNA疫苗，能诱导抗体产生、T细胞增殖、淋巴因子的释放及细胞毒 T细胞 (cytotoxic T lymphocyte, CTL)的活化。因现今研究主要以ＤＮＡ为主 ,故又称ＤＮＡ疫苗。DNA疫苗易具有制备容易、生产成本低廉、储存和运输方便、使用方法简单等常规疫苗无法比拟的优点。加之肿瘤核酸疫苗可将多个抗原表位基因克隆在同一表达载体 ,制备多表位ＤＮＡ疫苗，诱导产生针对多种不同抗原表位的抗肿瘤免疫。质粒ＤＮＡ可长期存在于接种部位的组织细胞内，不整合入宿主细胞基因组，这些优点显示出其在免疫治疗方面的良好应用前景。Conry等构建的以巨细胞病毒早期启动子/增强子控制的携带CEA全长cDNA的质粒,已试用于临床。
DNA疫苗能否激发抗肿瘤的 CTL及抗体反应并有效排斥肿瘤细胞生长，不仅与插入表达载体的编码基因有关，研究发现DNA疫苗所编码的抗原为靶抗原的变异体或异种同源体可能打破机体对肿瘤的免疫耐受，编码基因的表达蛋白不仅激发了机体抗肿瘤免疫反应 ,也诱发了机体自身免疫反应。Carpentier等在小鼠神经母细胞瘤模型中 ,用编码人源性 Hu D基因的DNA疫苗进行免疫 ，结果 51 %的小鼠肿瘤生长抑制 ，其中 1 4%达到完全消退。
核酸疫苗接种实质上是将外源 DNA或 RNA引入宿主细胞内 ,其安全性问题如DNA抗体形成、外来抗原持续表达带来的副作用以及导致宿主细胞恶性转化的可能性等有待进一步研究。
（五）以树突状细胞为基础的肿瘤疫苗
树突状细胞 (dendritic cells，DC) 是主要由骨髓单核细胞系分化来的一类淋巴细胞，作为机体内功能最强的抗原递呈细胞，DC表达高水平的MHC-Ⅰ、Ⅱ分子，共**分子B7-1、B7-2 ,细胞粘附分子ICAM-1、3以及淋巴细胞功能相关抗原-3等，能在体内外直接激活幼稚T细胞 ,促进 T辅助细胞和CTL的生成 ,也能促进 B细胞生成抗体。197 3年Ｓｔｅｉｎｍａｎ和Ｃｏｈｎ首先提出了DC的概念，由于在很长一段时间内对其来源和分化发育的途径缺乏了解，从而极大地限制了对其功能特点的研究。90年代以来人们在体外应用细胞因子大量扩增ＤＣ成功，这些都极大促进了该领域的研究，基于树突状细胞肿瘤疫苗的研究成为近年肿瘤疫苗研究的重要进展之一。
目前制备DC疫苗的主要策略有：①肿瘤抗原多肽致敏的DC疫苗；②完全细胞性抗原肿瘤致敏的DC疫苗，完全细胞性抗原修饰包括肿瘤细胞裂解物、肿瘤细胞提取物、肿瘤细胞的总RNA以及肿瘤细胞与DC的融合③转基因DC疫苗，包括肿瘤抗原基因、细胞因子基因、共**分子基因。
Siejo等率先报道了DC疫苗应用于脑肿瘤的动物实验结果，他们采用B16胶质瘤细胞致敏的自体DC免疫荷瘤鼠使其颅内肿瘤得以消退。随后相继有研究报道了采用脑肿瘤RNA、抗原多肽或肿瘤细胞提取物的致敏的DC疫苗对荷瘤动物的取得了较好治疗效果。人们对于肿瘤提取物或灭活的肿瘤细胞致敏的ＤＣ疫苗的临床应用存有忧虑，因为来源于病人自身的肿瘤组织有时会混杂正常的组织细胞 ,这样致敏ＤＣ的肿瘤提取物中也就包含了一些正常的抗原从而可能诱导自身免疫反应。最近的一项Ⅰ期临床实验中，Yu等采用自体肿瘤细胞抗原肽致敏的DC疫苗皮下接种辅助治疗7例多形性胶质母细胞瘤患者和2例恶性星形细胞瘤。治疗没有引起严重的副反应和自身免疫反应，仅一例患者接受疫苗后有短暂的低热、恶心、呕吐，另一例患者出现了浅表淋巴结肿大。实验取得了肯定的治疗效果，在检测7例患者中观察到4例患者外周Tc细胞活性增强，接受再次手术的4例患者中有2例出现了明显的瘤内CD45RO+记忆性T细胞和CD8+ Tc浸润。该组7例多形性胶质母细胞瘤的平均生存时间为455d，而对照组42例患者平均生存时间为257d 。结合前期DC疫苗应用于其它肿瘤临床治疗和脑肿瘤动物实验的研究结果，作者认为DC疫苗不会导致严重的自身免疫反应，对恶性胶质瘤的治疗有良好的应用前景。
DC疫苗用于肿瘤免疫治疗仍需解决很多问题,如 :① DC数量扩增有限和功能维持问题 ;②DC的迁移机制 ; ③DC与肿瘤抗原肽结合难以持久问题④如何针对肿瘤的免疫逃逸机制更为有效地利用 DC⑤DC瘤苗的标准化问题提高⑥DC基因转染效率的问题等。
三 抗肿瘤抗体的导向治疗
抗肿瘤抗体的导向治疗是抗体为“载体”，与“弹头”药物相连接而形成免疫偶联物，通过抗体与针对的靶标结合，从而使药物选择性作用于肿瘤局部的一种方法，它可减轻药物对正常组织的毒性作用，提高疗效。
（一）抗肿瘤单克隆抗体导向药物治疗概念
单克隆抗体对相应抗原具有高度特异性，是目前导向治疗中应用最多的抗体，生物分布研究表明，单克隆抗体偶联药物在体内的分布具有靶向性。抗肿瘤单抗导向药物治疗自八十年代以来进行了大量研究 ，特别是1997年以来Rituxan（抗Ｂ细胞CD2 0分子的人鼠嵌合抗体，用于治疗非霍奇金氏Ｂ细胞淋巴瘤）和Herceptin（抗HER 2 /neu癌基因编码蛋白的单抗 , 用于治疗乳腺癌）相继获得ＦＤＡ批准用于临床肿瘤治疗，单抗药物治疗肿瘤显示了良好的前景。
与单克隆抗体物偶联的“弹头”药物主要有三类 ,即放射性核素、化学药物和毒素，与放射性核素连接者称放射免疫偶联物,与化学药物连接者称化学免疫偶联物,与毒素连接者称免疫毒素。
（二）临床应用与展望
目前单克隆抗体导向治疗的临床应用主要涉及解决抗体免疫原性及针对性和肿瘤局部药物浓度两方面的问题。首先，由于多年来用于临床研究的导向药物多数使用小鼠单抗制备，机体产生的人抗鼠抗体(human anti-mouse antibody，HAMA)可对注入的单抗导向药物起中和作用 ,从而抵消其疗效反应，并可导致过敏反应避免或减少ＨＡＭＡ反应的主要途径是使鼠源性单抗人源化或研制完全的人源抗体。其次，单抗对相应的肿瘤抗原具有高度特异性 ,这也是单抗药物抗肿瘤作用具有靶向性的基础，现有的神经系统肿瘤抗原多为TAA或胚胎性抗原而缺乏特异性，寻求与肿瘤细胞相关的靶点是临床前期工作的关键。此外，尽管单抗药物在体内具有特异性分布 , 但由于单抗药物在体内的运送过程受血供状况多种因素影响,能到达肿瘤细胞的药物量仍属有限，如何提高单抗药物在肿瘤组织的浓度也是单抗药物治疗研究的重点。
表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFr) 在恶性胶质瘤常有较高表达，而在正常细胞表达很少，可作为脑肿瘤导向治疗的靶点。Miyamoto等采用125I标记的EGFr-425作为恶性胶质瘤和多型性胶质母细胞瘤患者常规治疗外的辅助治疗，EGFr-425是一类抗人EGFr的鼠源性IgG2A抗体，它与EGFr结合后可抑制其发挥作用。在2周内，每位患者平均接受了3次125I-EGFr-425静脉注射治疗，平均剂量为148毫居里（millicurie，mCi），接受治疗的60例多型性胶质母细胞瘤患者平均生存期为13个月，75例恶性胶质瘤为12个月，其中仅1例患者出现甲状腺机能减，单次剂量大于60 mCi时有6%的患者出现急性反应，故此方案副反应是相对较低的。最近，抗EGFr的人鼠嵌合抗体已开始进入临床研究，这将使EGFr作为靶点的抗体导向治疗更具潜力。
局部注射是提高单抗药物在肿瘤部位浓度的常用方法，通过脑肿瘤手术留置的导管进行瘤腔内用药也是提高药物剂量的有效途径。Hopkins 等报道通过瘤内注射针对神经细胞黏附分子(neural cell adhesion molecule， NCAM) 的单抗药物治疗复发的恶性胶质瘤，NCAM可表达于胶质瘤和正常神经胶质细胞，故注入肿瘤的药物可与周围的肿瘤或正常组织结合而避免扩散。两治疗组分别采用131I和 90Y作为偶联放射性同位素，多数患者的药物都能局限于瘤腔内，131I组和90Y组的瘤区放射剂量分别达到瘤外的10~350倍和140~900倍，而治疗的毒性反应较低，由于90Y较131I具有更高能量且其发射的b射线穿透力较弱，故更为安全有效，但该研究未对疗效进行比较。Riva 等采用131I标记的抗TN（tenascin，TN，是一类细胞外基质中与胶质瘤相关的高分子糖蛋白）鼠源性单抗治疗治疗恶性胶质瘤，病例包括26例初诊恶性胶质瘤和24例复发恶性胶质瘤。药物通过术中留置导管注入肿瘤残腔内，每次剂量可达到2405 MBq（65 mCi），下次给药根据病情在间隔3~4月后周期进行。治疗中部分患者出现了轻微和暂时的头痛、恶心，但无全身和神经系统的毒性反应，有69%的患者出现了HAMA，治疗3个周期以上的患者全部为HAMA阳性。24例复发胶质瘤患者和初诊恶性胶质瘤的平均生存期分别为18月和23个月。
今后抗体导向药物研究的目标是：①单克隆抗体的人源化，主要通过基因工程技术制备嵌合抗体或改型抗体，嵌合抗体的副反应轻 ,ＨＡＭＡ反应率较鼠源性单克隆抗体低 ,在血中半衰期也较长，完全的人源抗体则更为理想；②偶联物的小型化，大分子偶联物将难以穿透细胞外间隙到达实体瘤深部的肿瘤细胞，研制小型化偶联物对提高药物疗效有重要意义；③偶联药物的高效化，即使仅有微量的偶联药物到达靶部位任可发挥高效的肿瘤细胞杀伤力。

四 过继免疫治疗
过继免疫治疗 (adoptive immunotherapy)是将自体或异体的免疫效应细胞分离后于体外经扩增、修饰等处理后回输或转输给肿瘤患者，使其在体内发挥效应以增强机体抗肿瘤能力的一种疗法。用于过继免疫治疗的抗肿瘤效应细胞有淋巴因子激活的杀伤细胞(lymphokine activated killer，LAK) 、肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocyte，TIL）、细胞毒性T淋巴细胞 (cytotoxic T lymphocyte，CTL )等。免疫过继治疗的关键是需要在体外获取足量杀伤效力强的免疫活性细胞，治疗效果还与体内肿瘤细胞对免疫细胞的反应性、免疫细胞在肿瘤局部的聚集和存活时间以及宿主的肿瘤负荷等多种因素有关。
1980年Rosenberg等首先发现LAK细胞能够杀伤NK细胞抵抗的多种自体或异体肿瘤细胞，由于LAK细胞在体外激活和在体内的杀伤活性常需IL-2的参与，故也称LAK/IL-2疗法。自Jacobs等采用LAK细胞和IL-2治疗复发恶性胶质瘤Ⅰ期临床实验以来，原发性脑肿瘤的LAK细胞过激免疫治疗相继开展。尽管部分患者有临床表现或影像学表现的好转，但总的来说，生存率提高不令人满意，且治疗副反应明显，如头痛、发热、颅内压增高等。其主要原因是：效应细胞数量不足，杀伤活性差，特异性不强；大剂量的IL-2应用可导致脑水肿等副反应。
TIL是1986年从实体瘤组织中分离到的，在体外经 IL- 2激活后可大量扩增 ,并对肿瘤细胞具有高度杀伤活性。相对于LAK细胞，TIL对肿瘤细胞的杀伤活性强，持续时间长，并且具有一定肿瘤特异性。许多研究均已表明，CTL在体内外对脑肿瘤的杀伤效果均优于LAK细胞。但从脑肿瘤组织中分离和制备TIL存在一定困难，IL-2的副反应仍未解决，这些使TIL应用于脑肿瘤的临床治疗受到了限制。为了提高TIL的肿瘤靶向性，有人设想将抗肿瘤单链抗体基因转染入TIL中，以利于TIL与肿瘤细胞特异结合发挥杀伤作用，但关键在于能否将其特异性抗体恰当地表达于TIL表面并保持其活性。
另一项特异性的免疫过继疗法是局部给予自体肿瘤细胞致敏的T细胞，方法是先采用自体肿瘤疫苗免疫机体，再将特异性的T细胞分离出来并在体外进行扩增或肿瘤抗原致敏。一项研究发现，先用RT-2肿瘤细胞疫苗免疫大鼠后提取淋巴细胞，在体外由RT-2细胞致敏后回输延长了荷瘤鼠的生存时间。同法在9L胶质瘤大鼠模型也获得了类似的结果。已有报告将起用于恶性胶质瘤和复发胶质瘤的临床治疗，但病例数很少，安全性和疗效有待进一步研究。