糖尿病血糖控制的基因治疗任重而道远

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糖尿病血糖控制的基因治疗任重而道远
作者： 发布时间：2007-11-14 18:05:16 阅读：7


苏本利 大连医科大学附属第二医院内分泌科

1型糖尿病依赖胰岛素皮下注射治疗，随着2型糖尿病病程逐渐延长，绝大多数最终需要胰岛素治疗才能实现血糖达标。自从基因重组技术发明开始，人们就憧憬有朝一日实现胰岛素基因治疗，摆脱注射胰岛素的痛苦。上个世纪80年代末，就有人预测，到90年代有望实现人类胰岛素基因治疗。但是随着第一例因免疫重建基因治疗其免疫缺陷的患儿的死亡，基因治疗的临床试验几乎被全部封杀。当前在糖尿病相关治疗领域仅血管内皮生长因子（VEGF）基因治疗下肢缺血方面进入II－III期临床。目前尚无有关糖尿病血糖控制方面的基因治疗方案被药品管理局批准进行临床试验。因此，糖尿病血糖控制相关的基因治疗还需走很长的路才能见到曙光。

从基因治疗的技术层面现在的转导载体有病毒载体、非病毒载体，人造染色体；转导方式有体外转导/体内植入、静脉注射（脂质体，病毒 ）和直接或肌肉注射（电穿孔，脂质体，病毒）。 基因治疗实验程序有体外细胞转染用于检测工具基因可行性；转基因小鼠由于检测体内表达可行性和长期表达的安全性 ；静脉注射主要检测全身或器官特异性转染的可行性及安全性；肌肉注射检测肌肉局部表达的可行性及安全性 ；体外转导用于易于获取的组织或细胞进行体外基因工程细胞用于细胞移植的可行性。

鉴于糖尿病的基因治疗，有针对1型糖尿病的基因治疗，有针对2型糖尿病的基因治疗，还有针对糖尿病相关慢性并发症的基因治疗（下肢动脉闭塞症、糖尿病视网膜病变、糖尿病肾病、糖尿病神经病变，勃起功能障碍等）。外源基因在体内表达需要合适的宿主细胞。目前常用的宿主或用于外源基因转导的靶细胞有成纤维母细胞、骨髓间充质/造血干细胞、肝（卵圆）细胞和骨骼肌细胞。还有许许多多其他类型的细胞也可供基因治疗用，如脂肪细胞等。对于糖尿病基因治疗当前能获得的工具基因有：胰岛素基因，促进葡萄糖代谢基因，GK，PEPCK，脂联素基因，瘦素基因，POMC，胰岛细胞分化相关的转录因子基因，抑制β细胞凋亡和自身免疫损伤的基因，可诱导免疫耐受的蛋白质基因等。

就胰岛素基因治疗来讲，胰岛素基因体内转导需要考虑宿主细胞是否有葡萄糖反应单元，胰岛素原是否能成熟，胰岛素合成后是否能被储存及葡萄糖反应性分泌。由于胰岛素基因的成熟需要有PC1和PC1来完成，而目前大多数可用于外源胰岛素基因转导的细胞缺乏此蛋白酶，因此需要对胰岛素基因进行重组。目前采用最多的是对胰岛素cDNA的A-C和B-C交界处进行编码重组，以便能被所有宿主细胞都有的弗林蛋白酶（furin）酶切成熟。也有人对C肽编码部分进行改造，使胰岛素的AB两条链直接组装成不影响胰岛素功能的单链胰岛素类似物（SIA），无需蛋白酶使之水解。外源胰岛素基因表达常需根据不同宿主细胞而定，目前除了肝细胞系、肠粘膜内分泌细胞系、胰岛细胞系外多无葡萄糖表达和分泌的反应单元。因此，除上述细胞外，胰岛素基因的表达多为持续表达。

早期的胰岛素基因治疗所采用的宿主细胞多位成纤维母细胞，体外基因转导后移植至皮下。低活度的表达可实现基础血糖的控制，但也有发生胰岛素重组的成纤维母细胞移植体内后出现严重低血糖的研究报告。新近少数有关胰岛素基因在成纤维母细胞实现调控表达的报告多采用以非葡萄糖为诱导物的反应性启动单元，如PEPCK基因启动子、DBD-LBD-AD三联结构域启动子和HSP70基因启动子。

肝脏细胞与胰岛内分泌细胞同源，细胞活动中许多蛋白质的表达和功能方式在与胰岛β细胞相似，如表达GLUT2，有葡萄糖激酶，许多相关的代谢酶的基因存在葡萄糖反应单元（GIRE）。因此，目前多用肝脏细胞为宿主进行葡萄糖反应性胰岛素基因的表达和分泌来实现外源胰岛素基因体内基因治疗。相关的葡萄糖反应性重组启动子有L-PK GIRE，G6P GIRE，GLUT2启动子等。胰岛素基因对肝细胞体内转导多采用半肝切除后肝细胞分裂介导的逆转录病毒转导，利用重组腺相关缺陷病毒直接转导，脂质体、高压水动力学及电脉冲介导外源非病毒胰岛素表达载体的肝细胞转导。

鉴于骨骼肌具有体块大，易于进行基因转导操作，合成蛋白质和物质代谢的潜能大，对其进行操作一般不影响机体整体的代谢途径。因此，骨骼肌是外源基因理想的宿主组织或细胞，尤其对无需调控表达的生物活性蛋白或因子更为实用。但是肌肉缺乏胰岛素基因表达所必需的葡萄糖反应单元。因此，大多数基于骨骼肌的胰岛素基因治疗多为持续性表达。为实现胰岛素基因转导骨骼肌后实现可调控的表达，人们尝试了四环素-抗药基因表达系统。但是胰岛素可控表达并不能解决胰岛素分泌的与进餐相关的时序性。因此，设计了一种可实现骨骼肌按进餐时序相一致的调控性分泌体系－内质网可控性蛋白颗粒解聚体系。该系统可用较为安全的小分子与进食同摄入，进行餐后迅速胰岛素分泌的模拟生理性胰岛素分泌模式。

肠道粘膜内分泌细胞生物活性分子的分泌多与进食相关，肠道L细胞、K细胞具有和胰岛β细胞相同的蛋白质分泌的感应系统，胰岛素基因转导这些细胞后可实现葡萄糖敏感性胰岛素分泌。肠道G细胞可实现葡萄糖敏感的胃泌素＋胰岛素的分泌。美国人所申请的口腹基因片可能是基于此原理来实现口腹基因片治疗糖尿病的。

其他的胰岛素基因工程细胞有骨髓干细胞、脐带干细胞研究，还有PHHI工程细胞、**-neomycin介导的胰岛素表达ES细胞系等。

GK除了具有葡萄糖感受器的作用外，还具有强大葡萄糖代谢和促进糖原合成的作用。GK基因转导骨骼肌和肝细胞后可实现不依赖于胰岛素的显著降糖作用。PEPCK是肝脏葡萄糖异生的关键酶，糖尿病是PEPCK活性增强，肝脏产糖过多是导致糖尿病时空腹和餐后血糖升高的关键步骤。利用具有负调控作用的PEPCK干扰RNA技术可显著地改善糖尿病小鼠的葡萄糖控制状态。肝脏虽然具有与胰岛β细胞葡萄糖反应单元，但不具有生理性合成和分泌胰岛素的功能，利用胰－十二指肠转录盒和促进胰岛β细胞分化的转录因子可使肝细胞向类胰岛细胞分化，具备葡萄糖调控胰岛素的合成和分泌功能。虽然肝细胞在PDX1作用下分化成为类胰岛β细胞，但也同时发生了严重的炎症反应，具体原因不明。实验种所使用小鼠发生糖尿病的机制，基因转导所借助的病毒颗粒可能与此有关。

1型糖尿病发病机制以自身免疫性胰岛β细胞损伤为特征。胰岛炎的启动与机体对胰岛β细胞的失耐受有关，而胰岛β细胞破坏速度除了和自身免疫的活度和β细胞抗损伤能力有关。今年来基于自身抗原诱导的免疫耐受取得的长足的进展。基于原理所设计的基因治疗研究也发现GAD基因疫苗可显著减轻或阻止自身免疫性胰岛炎的发生、进展和糖尿病的发生。不同免疫调节作用淋巴因子种类和比例不同在启动自身免疫发展趋势和胰岛β细胞损伤方面起到了重要的作用。基于保护性淋巴因子的基因治疗研究发现，IL4、IL10、HGF，TGF1β、IFN能具有免疫调节作用的淋巴因子可显著减轻胰岛炎程度，阻止或减少糖尿病的发生。

慢性的活度炎症是胰岛素抵抗及代谢综合征的特征，不仅是2型糖尿病发生的始动或促进因素，也是1型糖尿病发生的促进因素。糖尿病个体在代谢综合征或胰岛素抵抗状态、血糖升高前就存在高于非肥胖和胰岛素敏感非糖尿病个体水平的蛋白质非酶促糖基化终末产物（AGE）。这时循环中的AGE主要来源于食物或机体广泛的活度慢性炎症过程。食源性、高糖**的AGE具有同样的促炎症、促氧化应激的作用。我们通过肌肉表达游离型AGE受体（sRAGE）和直接腹腔内直接注射sRAGE或抗RAGE单抗的作用相同，均具有减轻机体氧化应激的产生。我们还发现肌肉表达的sRAGE在降低机体氧化应激产物（MDA）的同时，还能提高机体抗氧化应激的能力（SOD），显著减少STZ诱导的高脂餐SD大鼠糖尿病的发生。

2型糖尿病不是以胰岛素缺乏为主要特征，而是表现为胰岛素作用不足和胰岛β细胞分泌胰岛素生理性特征发生了改变。新近研究发现2型糖尿病时，病人肠道L细胞分泌具有促进胰岛β细胞葡萄糖反应性的GLP1水平明显低于非糖尿病者。皮下注射GLP1可显著改善2型糖尿病的胰岛素敏感性和胰岛素分泌。肌肉注射可持续表达GLP1的质粒或静脉注射Ad介导的肝脏GLP1表达可使db/db和ob/ob小鼠体重恢复正常，避免糖尿病的发生。

质联素具有明显的抗慢性炎症的作用，肥胖、胰岛素抵抗者质联素水平低于非肥胖和胰岛素敏感者。小鼠尾静脉注射质联素可使STZ糖尿病小鼠的肝脏摄取葡萄糖的能力增强，小鼠血糖和甘油三酯水平降低，可使高脂餐诱导的肥胖C57BL/6J小鼠的胰岛素敏感性恢复正常，血糖水平降低。瘦素的作用至今未明，瘦素基因突变的小鼠和瘦素受体基因突变的小鼠表现为肥胖、胰岛素抵抗和糖尿病。静脉注射Ad介导的瘦素表达，肌肉注射瘦素表达质粒均可显著纠正ob/ob小鼠的体重和代谢紊乱。瘦素表达可抑制MCH-ICR小鼠食欲。因此，基于质联素和瘦素的基因治疗体系可能有助于肥胖性2型糖尿病的治疗。

总之，就糖尿病基因治疗而言，对于胰岛素绝对缺乏的1型糖尿病病人，胰岛素基因替代治疗是必不可少的。非调控基础胰岛素基因表达虽然在一定程度上改善血糖控制程度，但是很难实现安全，全方位的血糖达标。基于肝细胞、肠道内分泌细胞的体内胰岛素基因治疗可能更合理，但是肝脏胰岛素基因转导，肝脏转化转录因子基因转导的有效性和安全性仍需更大的创新，经肠道肠粘膜内分泌细胞胰岛素基因治疗探索有助于实现避免非肠道基因转导相关的不安全因素。对于缓慢进展的自身免疫性糖尿病，纠正免疫紊乱，提高胰岛β细胞的抗损伤能力，最大限度地保留内源胰岛β细胞的体积和胰岛分泌能力可能是比较实际的途径。对于2型糖尿病，由于胰岛素作用的不足，补充胰岛素基因治疗可能不实用，因为一般异位胰岛素基因表达很难满足胰岛素抵抗对胰岛素剂量的需求。改善胰岛素抵抗的基因治疗措施可能更有利于血糖控制的改善。因为，持续表达改善胰岛素抵抗的基因治疗措施更简单，无需葡萄糖敏感性分泌的治疗工具设计，骨骼肌是外源基因介导的持续性生物活分子治疗措施最理想部位。同样，基于骨骼肌作为宿主的基因治疗仍需要研制实现外源基因转导效率更高，更确实可信的工具基因和探索更为有效的转导方案。