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[各科交流] 干货,多能干细胞冻存/解冻标准流程!

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发表于 2018-7-4 17:37 | 显示全部楼层 |阅读模式

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多能干细胞的冻存和解冻
今天我们就来重点介绍细胞聚集体冻存和解冻的标准化流程:
解冻复苏方案适用于在冷冻保存之前在mTeSR™1中维持培养的人ES和iPS细胞。对于其他方案培养的细胞(例如使用饲养层细胞或其他条件培养基,或无饲养层培养基如TeSR™E8™或TeSR™2),应当使用冷冻保存之前相同的培养基和条件下进行解冻。复苏后,细胞可以转换到mTeSR™1培养基。
mFreSR™(产品号 #05854)是一种成分确定、无血清的冻存液,专门为在mTeSR™1中培养的人ES和iPS干细胞设计。为即用型且含冻存保护剂。
先达基因支原体检测试剂盒提供了一种快速简单灵敏的细胞支原体检测方法,能检测的支原体种类超过130种两步操作,20min出结果先达基因支原体检测,从未如此简单
1. 冻存
注意:开盖之前,用70%的乙醇或异丙醇擦拭瓶身。
以下说明适用于在mTeSR™1中培养的6孔板培养物的冻存,使用mFreSR™ 或CryoStor® CS10皆可。培养物应该在适合传代的时候进行收集和冻存。每管所含有的细胞应当来源于6孔板的1个培养孔。如果使用其他的培养器皿,请相应的调整体积。
注意:如果使用mFreSR™,融化所需量的mFreSR™然后放置于冰上。
1) 用无酶方法进行传代至第8步,或者用有酶传代方法至第10步。
2) 在室温(15 - 25°C)以300 x g离心5分钟。
3) 轻轻吸走上清液,注意不要扰动细胞团。
4) 用血清学吸管以1 mL的mFreSR™或CryoStor® CS10重悬细胞。在打散细胞团时,尽量减少细胞聚集体分解。
5) 用2 mL的血清学吸管将1 mL的细胞聚集体转移到标记好的冻存管中。
6) 用以下方法冻存细胞聚集体:
推荐使用缓速降温方法,每分钟降低1度,随后可以在 -135°C液氮或更低的温度长期保存。 不推荐在 -80°C长期保存。
逐步降温法:-20°C保存2个小时,然后 -80°C中保存2个小时,随后可以在 -135°C液氮中或更低的温度长期保存。
2. 解冻
ES和iPS细胞在解冻后,应该立即铺板在预先包被好的培养皿中。上述冻存的一管细胞可以成功的铺板到6孔板的 1 - 2孔。
1) 开始之前,提前准备好以下材料:试管,恢复到室温的mTeSR™1(15 - 25°C),及预先包被的培养板,确保整个解冻复苏程序可以在最短的时间内完成。
注意:不要在37°C水浴中加热mTeSR™1 培养基。
2) 在37°C水浴中快速解冻,持续温和的在水中晃动冻存管,直到剩余少量细胞还处于冻存状态。
3) 从水浴中取出冻存管,用70%的酒精或异丙醇擦拭除菌。
4) 用2 mL的血清移液管把细胞悬液转移到一个15 mL的锥形试管。
注意:用2 mL的血清移液管代替1 mL的枪头可以减少细胞聚集体的分解。
5) 逐滴加入5 - 7 mL的预热的mTeSR™1培养基到15 mL的离心管中,加入的同时轻轻混匀。
6) 室温(15 - 25°C)以300 x g离心5分钟。
7) 吸出培养基,使细胞沉淀完好无损。 使用2 mL血清移液管轻轻将细胞沉淀重悬于1 mL的mTeSR™1中。小心保持细胞作为聚集体。
8) 将0.5 mL的细胞混合物转移到含有mTeSR™1的预包被的6孔板的培养孔中(例如,每个冷冻管可以铺板两个孔)。
注意:铺板多少孔可能需要根据冻存的细胞聚集体数量进行调整。通常在复苏后,要比在常规的传代铺板更多的细胞聚集体数量。
9) 将培养板放入37°C培养箱。快速前后左右的摇晃培养板数次,将细胞聚集体分布均匀。24小时内不要移动培养板。
注意:不均一的聚集体分布可能会导致人ES和iPS细胞分化增加。
10) 用mTeSR™1每天换液,目测培养物以评估生长状态直到下一次传代。解冻复苏后的6 - 7天,查看是否有适合传代的(中心致密的)未分化的集落。
注意:解冻复苏后如果只能观察到少数的未分化的集落,只选取这些未分化的集落进行传代,并将它们铺板至相同大小的新包被的培养孔(不进行稀释传代)。

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