儿童腹泻病的病原及其检测方法

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儿童腹泻病的病原及其检测方法
原创 2016  儿科学大查房
综述目的  小儿感染性腹泻病的病原主要为病毒，其次为细菌，真菌引起的腹泻相对较少见,病原检测是作出临床诊断的重要依据。

综述方法  对Pubmed和万方数据库中1990年至2011年与腹泻病原检测方法相关的文献进行检索与回顾，总结与儿童腹泻病相关的病原及其检测方法。

最新进展  腹泻病的病原学检测方法包括电镜法、培养法、免疫学方法及分子生物学方法等。其中巢式聚合酶链反应（PCR）、多重PCR、实时荧光定量PCR检测技术不仅在病毒检测方面有广泛应用，在细菌、真菌和寄生虫检测方面也开始应用，其可用于同时检测几种细菌，提高了检测的阳性率。基因芯片技术仅用于部分病原学研究。

总结  病原学证据是临床诊断的重要依据。随着检测方法的不断创新，病原学的诊断能力也逐渐提高。

引言

小儿腹泻病是儿科常见病之一，是由多种病原引起的一种疾病，其病因的判断依赖于临床病原学、治疗效果等综合判断。其中病原学证据又是作出临床诊断的重要依据。腹泻病原学的研究随着对疾病的认识和检测技术的提高而不断深入。本文对引起腹泻的病毒、细菌、真菌以及寄生虫的研究进行综述。

病毒

病毒是儿童感染性腹泻的重要病原，引起儿童腹泻的常见病毒包括轮状病毒（rotavirus，RV）、人杯状病毒（human calicivirus，HuCV）、星状病毒（astroviou，ASV）、肠道腺病毒（entericadenovirus，EADV）等。

轮状病毒

在病毒引起的腹泻病中，RV是占首位的病因。全世界每年因为RV感染导致约1.25亿婴幼儿腹泻和90万婴幼儿死亡。1973年澳大利亚Bishop等研究婴幼儿急性胃肠炎时，用电子显微镜在粪便中找到RV颗粒。根据病毒具有车轮状形态特征，1975年该病毒被国际病毒分类组织定名为RV。RV归于呼肠孤病毒科，轮状病毒属，根据其内壳蛋白VP6抗原性的不同，将其分为A、B、C、D、E、F、G七个群，依据外壳结构蛋白VP7的不同区分血清型（称为G型），分为G1、G2、G3、G4，常被用于制备疫苗。病毒流行株在各个地区以及各个地区的不同时期都有不同。A组RV是全球各地儿童胃肠炎的主要病原体，超过90%的3岁以上婴幼儿都存在RV感染，在5岁以下腹泻患儿中，RV所致腹泻占20%~70%[1,2]。

目前检测RV的常用方法有以下几种：

电镜法：最经典的检测技术，简便、快捷，但设备昂贵，病毒颗粒降解后易出现假阴性结果[3]。

培养法：分离培养技术需要特殊的培养条件，灵敏度低，且目前仅可培养A组RV，故本法对于诊断和科研的作用有限。

免疫学检查技术：本法的检测对象多为患者粪便标本中的RV抗原。该免疫学检查技术包括：①酶联免疫吸附试验（ELISA），该方法操作简单，灵敏度和特异度高，无放射污染，无需特殊仪器，准确性高。② ELISA双抗体夹心法，可根据检测目的不同，设计包被抗体和检测抗体，本法还可用于血清分型、毒株鉴别，适用于大规模临床检测和流行病学调查。③离心强化固相免疫分析，该方法造价低廉，易于实施，可肉眼观察或照相记录，也可通过微量反应板比色计定量计数，因此，适于临床和实验室广泛应用。④乳胶凝集试验：采用本法检测RV的优点包括容易操作，对操作技术要求不高，并且无需昂贵的仪器和设备，只需2、3 min便可以判断结果，对应急标本的筛查和初步检测有很好的时效性，易于在基层防疫部门开展。总之，RV的免疫学检测方法日益成熟、稳定，具有很高的灵敏度和特异度，基本能够作出快速、准确的早期诊断。

基因检测技术[4]：①丙烯酰胺凝胶电泳法：聚丙烯酰胺凝胶电泳的灵敏度和特异度较高，能在基因水平上分析不同毒株间的异同。琼脂糖电泳操作简单、快速（<3 h），可用于RV的快速诊断。②聚合酶链反应（PCR）技术的灵敏度更高，可检测储存较长时间的标本及多样环境样本，其扩增产物可用于基因研究工作，包括多种技术，如巢式PCR、多重PCR、实时荧光定量PCR等。③基因芯片技术是一种微型化、高通量的自动化检测技术，目前研发的RV基因芯片，多用于毒株的分组、分型及新毒株的鉴定等病原学研究[5-7]。

人杯状病毒

HuCV是引起儿童非细菌性腹泻的重要病原体，它分为两属：诺如病毒（noroviru，NV）和札如病毒（sapovirus，SV）。1968年美国俄亥俄州诺瓦克的一所小学内暴发急性胃肠炎，1972年Kapikian等用电镜检查1968年急性胃肠炎患儿粪便标本时发现了NV，它是人杯状病毒科诺如病毒属的原型代表株。1975年Madeley和Cosgrove用电镜检测小儿粪便标本时发现HuCV。1995年我国报告第1例NV感染。根据人类所感染NV株的基因序列进行分析，可把NV分为3个基因群，即GⅠ、GⅡ和GⅣ，其至少又可分为25个基因型和大量亚群。对新世纪多次暴发的腹泻病原体进行分析表明，GⅡ基因群NV已是当前引发全球胃肠炎、腹泻最常见的毒株[8]。中国疾病预防控制中心方肇寅等[9]收集了我国长春、北京、河北等13个地区1999年至2005年5岁以下腹泻患儿的粪便标本4426份，其中HuCV的检测阳性率为19%，以NV为主，占96.7%。

检测NV的常用方法如下：

电镜法：电镜法包括直接电镜法和免疫电镜法，本法设备昂贵，灵敏度低。

免疫法：免疫法包括放射免疫法（RIA）、生物素—亲和素免疫法（biotin-avidin immunoassay）和ELISA。RIA法的灵敏度高，可检测出抗体升高的水平，但耗时，且需要使用放射性同位素标记。为了简化方法，美国疾病预防控制中心（CDC）建立了生物素—亲和素免疫法，其灵敏度与RIA法相当，目前已成为美国CDC检测NV抗原和抗体的标准实验方法。1992年Jiang等重组杆状病毒表达NV衣壳蛋白成功后，建立的NV酶联免疫检测方法具有快速、灵敏、经济的优点。不足之处为免疫反应的株型特异度太高，应用范围较窄。

分子生物学检测方法：逆转录—聚合酶链反应（RT-PCR）方法特异度高、灵敏度高，能检测出低到20~50拷贝的病毒核酸，是目前最快速且灵敏的检测方法。近年，研究者开始应用等温核酸扩增法（nuclieic acid sequence-based amplication，NASBA）直接扩增RNA检测NV。此方法的灵敏度略低于RT-PCR法；整个过程只有一步RNA扩增，避免了RT-PCR存在的DNA交叉污染，缩短了操作时间，假阳性率低[10-12]。

星状病毒

ASV于1975年首次由Appleton等在急性胃肠炎患儿的粪便中用电镜观察到，1976年Madeley依据病毒外形呈五或六角星状而将其命名为ASV。1981年Lee和Kurtz报告人星状病毒（HAstV）可用于细胞培养和传代。现已证实，ASV是引起婴幼儿、老年人及免疫功能低下者腹泻的重要原因之一。HAstV为无衣壳单股正链RNA病毒，属于ASV科。HAstV至少有7个血清型。与RV一样，ASV感染具有明显的季节性，在温带地区的流行季节一般为冬季，而在热带地区的流行季节为雨季[13-15]。

ASV的诊断方法和RV、杯状病毒等一样经历了一个由单纯依靠电镜观察到运用各种免疫学方法、分子生物学技术检测的过程，其主要检测方法如下：

电镜法：电镜法敏感度低，且不能用于分型。

免疫法：免疫法主要包括免疫电镜法、RIA、免疫荧光法（QFA）、酶免疫法（EIA）等，利用种特异性或型特异性抗体可检测出ASV 8个血清型，还可使用不同血清型的完整病毒或基因工程法制备部分衣壳蛋白进行血清流行病学研究。

分子生物学方法：该检测方法不断发展，包括RT-PCR、多重实时逆转录PCR（RT2-PCR）、基因芯片技术以及核酸序列依赖扩增技术。1995年Noel等通过对编码衣壳蛋白基因——ORF2测序发现一段384 bp区域，这段区域在相同血清型HAstV中是相同的，但在不同血清型的毒株间是不同的，从此研究者开始用RT-PCR的方法对ASV进行分型。Beuret等使用RT2-PCR，可以同时检测NVⅠ、Ⅱ型，肠道病毒，HAstV 3种病毒，并且将检测时间缩短到3 h。而且，此方法可以检测标本中ASV的病毒载量。定量RT2-PCR相较于传统的RT-PCR有许多优点，包括PCR反应完成后无需经过其他反应即可进行病毒载量测定，可以实时监测PCR过程，可减少RT-PCR反应中的污染，敏感度高等。基因芯片技术：2008年Brown等根据单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNP）检测芯片的思路，针对HAstV的8个血清型ORFlb区部分片段的保守和高变区，设计一系列长度为17个核苷酸的探针用于基因分型。核酸序列依赖扩增技术（nucleic acid sequence based amplification，NASBA）：此法较RT-PCR法用时短，不会发生DNA污染，但也有其局限性，需进一步联合其他方法进行基因测序和病原检测[16]。

肠道腺病毒

EADV是20世纪80年代发现的一种导致婴幼儿腹泻的新主要病原。EADV感染呈全球性分布，世界各地均有报告。各国的研究显示由EADV感染导致的婴幼儿急性腹泻的发病率为1.1%~12.0%[17-19]。50年代初，Rowe等在切除的儿童腺体细胞培养物的自发性退行性病变中，首次发现腺病毒；1975年F1ewett等首次应用电镜技术，在急性胃肠炎患儿粪便中发现与婴幼儿胃肠炎直接相关的腺病毒。这些在电镜下观察到的大多数腺病毒，均不能在常规应用的腺病毒细胞培养系统中培养，这些腺病毒被称为EADV。1981年Takiff等首次用Graham 293细胞分离成功，推动了对EADV的研究。1995年程绪杰等首次在我国从腹泻患儿粪便中分离到EADV。

检测EADV的常用方法包括以下几种：①电镜法和免疫电镜法；②细胞培养；③ 免疫学方法：ELISA的特异度和敏感度较高，并且快速、特异、操作简便。免疫斑点法（DIA）比ELISA更为简便快捷、经济且易于推广，适用于腺病毒的快速诊断及流行病学调查；④分子生物学方法：包括DNA分子杂交法、基因电泳、PCR等。DNA分子杂交法已用于EADV的检测和分型，该法特异度高，诊断迅速，但DNA探针制备过程复杂，技术要求高。PCR方法简单、快速，灵敏度和特异度均较高。实时定量荧光PCR（real-time PCR）是目前最先进的检测方法，在传统PCR的基础上，使用了荧光探针技术，提高了检测结果的特异度和敏感度，并可以对检测物质进行量化，该方法现已用于EADV的检测[20]。此外尚可使用基因芯片技术，能同时检测多个病毒，是研究的趋势[21-23]。

近年来的研究表明，随着原子力显微镜技术（atomic force microscopy，AFM）在生命科学领域尤其是在病毒学研究中的应用，人们可对各类病毒粒子超微结构如包膜蛋白、DNA/RNA实现精细观测，对病毒和受体相互作用力进行测定，对病毒致病机制进行研究等，这使AFM成为病毒学研究不可或缺的手段之一[24]。多重荧光RT-PCR检测方法的建立及临床应用使同时检测多种腹泻病毒成为可能[25-27]。

细菌

细菌是引起儿童腹泻的另一重要感染源，仅次于病毒。在我国，引起儿童腹泻的主要致病菌有大肠杆菌、沙门氏菌、志贺菌、肠球菌等，此外，近年来在儿童中，变形杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌等也有报告。

七省一市腹泻病科研协作组于1986全年监测主要病原，其调查结果显示，在我国农村，小儿感染性腹泻病主要病原依次为：①致泻性大肠杆菌，② RV，③志贺菌，③ 空肠弯曲菌，⑤ 沙门菌；而在城市有所不同，依次为：① RV，②致泻性大肠杆菌，③志贺菌，④ 沙门菌，⑤ 气单胞菌。随着经济发展、人们生活水平提高，其发病率在逐渐下降。常见致病菌在减少，条件致病菌相对增加，耐药细菌也在增加。陈强等通过PCR检测和DNA测序联合应用，并同时采用脉冲场凝胶电泳技术检测引起儿童腹泻的沙门菌耐药基因，在国际上首次发现了鼠伤寒沙门菌的blaCTX-M-55基因、汤普森沙门氏菌的blaDHA-1型AmpC酶基因。通过不同检测技术，进行病原分析，为临床合理治疗提供了重要依据[28]。

检测细菌的常用方法包括以下几种：

电镜法：采用高倍镜鉴别种属，油镜可用于观察各种染色涂片细菌镜检。

细菌分离培养：将粪便标本接种于SS、McK、McS等培养基上，观察菌落形成。然后进一步行生化检查和血清学鉴定。

生化反应鉴定肠道病原菌：根据生化特性，可对各类肠道病原菌进行初步鉴定。

免疫血清学试验：最常用的是ELISA，其可用于检测肠道病原菌的抗原及其产生的各种毒素。本法操作简单，现已被广泛应用。

分子生物学诊断：PCR是近十多年来应用最广的分子生物学检查方法，在致病菌的检测中，均以其遗传物质高度保守的核酸序列设计特异引物，进行扩增，进而用凝胶电泳和紫外核酸检测仪观察扩增结果。其中，依赖PCR的DNA指纹图谱技术、多重PCR检测技术、荧光PCR、基因芯片技术、定量PCR检测技术等应用也相当广泛。近年来随着基因芯片技术的发展，通过运用通用芯片技术平台，已可以建立快速、准确、高通量检测致病菌的方法[29-35]。

真菌及寄生虫

真菌

引起腹泻的真菌主要包括念珠菌、曲霉菌、毛霉菌、放线菌、隐球菌等，以白色念珠菌引起的肠炎最为常见。近年来，由于广谱抗生素、激素、免疫抑制剂、放化疗药物的应用，肠道真菌感染日益增多，对于真菌常用的检测方法包括以下几种：

① 直接显微镜检查和涂片染色镜检，镜检法便于早期检查，但易污染且难以鉴定种属；

② 培养法；

③ 血清学检查，可以检测真菌的抗原、代谢产物和抗体，敏感度和特异度高[36-38]；

④ 分子生物学诊断，该检查方法包括PCR、基因芯片技术、DNA 序列分析、分子核酸杂交技术等，本法灵敏度高，阳性率高于培养法，可用于种属鉴定，但易出现假阳性结果，且对技术条件要求较高[39-45]。

寄生虫

儿童寄生虫性腹泻病常见的病原包括阿米巴原虫、蓝氏贾第鞭毛虫、隐孢子虫、肠内滴虫和小袋纤毛虫、血吸虫、华支睾吸虫、钩虫等。阿米巴原虫性腹泻与蓝氏贾第鞭毛虫性腹泻在婴儿中常见；而鞭虫、粪类圆线虫及血吸虫感染在较大的儿童和年轻人中较为多见。

近年来，对隐孢子虫、人芽囊原虫、圆孢子虫在感染性腹泻中作用的研究，引起了临床关注。其中，隐孢子虫肠炎已成为全世界六大腹泻病因之一，占寄生虫性腹泻病的首位或第2 位；人芽囊原虫是小儿肠炎重要的致病寄生虫，是小儿迁延性腹泻的重要病因。

对于寄生虫，常用的检测方法包括：

① 病原学检查，粪便镜检或直肠黏膜活组织检查；

② 免疫学诊断，本法特异度及敏感度高，检查方法简单，常用方法有皮内试验、ELISA、免疫金标记技术等；

③ 分子生物学技术，主要包括核酸探针、PCR、生物芯片技术[46-50]。

小结

小儿感染性腹泻病病原主要为病毒，其次为细菌，真菌等引起的腹泻相对较少见，对于小儿感染性腹泻，常用的病原学检测方法包括电镜法、培养法、免疫学方法及分子生物学方法等。病原学证据是临床诊断的重要依据。随着检测方法的不断创新，病原学的诊断能力也逐渐提高。通过不同检测技术，进行病原分析，可为临床合理治疗提供重要依据。

沉**悟

理论性很强，慢慢消化。

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此消息发自iPhone版诊疗助手