诱导多能干细胞治疗缺血性卒中：现状和挑战

芭*凉

卒中的致死率和致残率均很高，其中约85％为缺血性卒中。对于缺血性卒中患者，目前比较明确的治疗方法是应用重组组织型纤溶酶原激活剂(recombinant tissue plasminogen activator，rtPA)溶栓或机械取栓术恢复血流。然而，这2种治疗方法都有一定局限性，即使经过治疗，梗死区坏死的神经细胞无法再生，相对应出现的神经功能得不到恢复。


近年来，随着干细胞移植技术在神经变性疾病中的应用，其也逐渐被考虑用于缺血性卒中的治疗。其中，最主要的干细胞来源是胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESC)。ESC取自早期胚胎，且异体移植时易发生免疫排斥，因此其应用受到了一定的限制。作为另一类型干细胞，诱导多能干细胞(induccd plu**otent stem cell，iPSC)能从多种体细胞中提取，如神经细胞、角质细胞、胃内细胞、肝细胞和黑色素细胞等，来源方便且能实现自体移植，从而回避了伦理问题和避免了免疫排斥，因此在治疗相关疾病方面有着极为广阔的应用前景。现就iPSC移植治疗缺血性卒中的现状、机制及其在临床应用中面临的挑战做一综述。


一、iPSC治疗缺血性卒中的现状


缺血性卒中是由于颅内血管闭塞引起的血流阻断所致，梗死区会出现多种细胞的凋亡或坏死，因此，最理想的治疗方法便是植入某种能替代多种细胞类型的细胞。骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cell，BMSC)和神经干细胞(neuralstem cell，NSC)移植已被证实能促进神经损伤和神经变性疾病的功能恢复，其机制可能是植入的干细胞能分化为神经元和神经胶质细胞或**内源性修复途径(如轴突芽生、神经发生和新生血管形成等)，后者对于神经功能恢复的贡献可能更大。然而，目前iPSC移植治疗缺血性卒中的疗效尚未得到明确证实，仍需进一步研究。


Jiang等利用大鼠大脑中动脉闭塞模型(middle cerebral artery occlusion，MCAO)进行的研究显示，将iPSC通过立体定向技术植入缺血同侧脑实质后，植入细胞能迁移到脑损伤区，并未引起癫痫或痉挛性运动，反而成功分化成类神经元细胞，显著缩小梗死体积，同时还显示植入细胞后4～16 d大鼠感觉运动功能显著恢复。同样，Chen等直接将iPSC注射至MCAO大鼠脑皮质损伤区发现，iPSC移植能显著缩小梗死体积、改善运动功能、减少促炎性细胞因子释放以及调节神经保护。Gomi等的研究显示，iPSC在一定条件下能分化为神经前体细胞，这些细胞不仅能在体内存活，还能长出轴突延伸至MCAO模型小鼠的脑缺血区；行为学评价显示，iPSC移植能显著促进脑缺血小鼠神经功能恢复。Oki等将从iPSC衍生而来的类神经上皮干细胞移植入卒中模型小鼠颅内，分别统计其找回和吃掉的小球数量来分析动物的行为学变化，结果表明，在移植后1周即可观察到显著的行为学改善。Wang等的研究显示，MCAO模型大鼠经侧脑室植入ESC或iPSC后7 d即观察到iPSC和ESC处理组与对照组神经功能评分出现显著性差异，而iPSC与ESC处理组之间无显著性差异，提示iPSC能成为理想的ESC替代者。


然而，也有部分研究得出了相反的结果。Jensen等将人源性iPSC在体外分化成NSC早期阶段，然后在大鼠MCAO后1周时植人NSC或媒介物。结果表明，植入细胞能在动物体内存活，也能分化成神经元，且未见肿瘤形成，但令人失望的是，并未观察到梗死体积的显著缩小和行为学方面的改善。


二、iPSC治疗缺血性卒中的机制


缺血性卒中导致的神经功能缺损主要是由于各种神经细胞的脱失，包括神经元以及不同类型的神经胶质细胞等。作为一种多能干细胞，iPSC能分化为多种类型的细胞。业已证实，卒中模型动物植入iPSC能有效促进神经功能恢复，该过程是通过多方面因素相互或共同调节的，其中可能包括分化为神经细胞和促进新生血管形成等。


iPSC自身神经分化


Wemig等直接将iPSC移植至胎鼠脑内发现，植入细胞能迁移到小鼠脑内的各个区域，分化为胶质细胞和神经元，包括多巴胺能神经元、谷氨酸能神经元、1-氨基丁酸能神经元以及儿茶酚胺能神经元亚型等；同时还发现，因植入的iPSC能分化为多巴胺能神经元，从而能够改善帕金森病模型动物的功能障碍。


除了目前讨论较多的多巴胺能神经元，iPSC也能分化为各种神经细胞，其中包括NSC、神经前体细胞(neural progenitor cells，NPC)和星形胶质细胞等。Czepiel等的研究显示，iPSC在体内外均能分化为具有功能的少突胶质细胞，从而为iPSC移植用于治疗脱髓鞘疾病(如多发性硬化)提供了理论支持。Karumbayaram等的研究也显示，iPSC和ESC均可分化为运动神经元，且两者分化形成的运动神经元难以区别。还有证据表明，iPSC能分化为特定区域的功能性神经细胞，如前脑谷氨酸能神经元。另外，植人的iPSC能在脑缺血模型动物脑内分化为神经元，并发出轴突至苍白球，也能接受动物本身神经元的突触传入。该实验结果为iPSC移植用于治疗缺血性卒中提供了理论支持。


促进血管发生


Oki等将iPSC衍生的类神经上皮干细胞移植入脑缺血模型动物体内，在移植后1周即可观察到显著的行为学改善；然而，这种改善很可能不是因为替代了神经细胞，而是归功于血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)水平的升高。业已证实，NSC诱导产生的VEGF在新生血管形成和抑制炎症反应等方面起着重要的作用。Suzuki等的研究显示，直接在局部缺血区植入iPSC源性Flk-1(VEGF受体)阳性细胞对于促进新生血管形成非常有价值。总体而言，多方面的研究结果均表明，iPSC能直接或间接促进新生血管形成，这一作用预示着iPSC移植在缺血性卒中的治疗方面具有潜在的前景。


三、iPSC治疗缺血性卒中面临的挑战


iPSC的致瘤性


有证据表明，多能干细胞具有致瘤性。Kawai等将未分化iPSC植入短暂性MCAO模型小鼠和对照组同侧纹状体和皮质，移植后28 d发现，MCAO小鼠脑内形成了较对照组大得多的畸胎瘤。然而，植入iPSC后形成畸胎瘤的机制尚未明确，可能为多方面因素共同作用所致，其中讨论最多的是诱导时所使用的转录因子。在将iPSC移植入MCAO模型小鼠的实验中，Yamashita等发现，c—Myc、Oct3/4和Sox2这3种诱导iPSs形成的转录因子在iPSC衍生的肿瘤中过度表达，提示这些转录因子在iPSC的致瘤性中可能起着一定的作用，而这一假设可以解释为这些转录因子本身便存在癌基因。其中，Myc已被明确为癌基因，其他2种转录因子也在多种类型的恶性肿瘤中过度表达。


为了避免其致瘤性，需要在移植前对移植细胞进行纯化。已有多种方法被证实能有效鉴别和(或)去除未分化ESC，包括磁性活化细胞分选(magnetic-activated cell sorting，MACS)、荧光活化细胞分选(fluorescence—activated cell sorting，FACS)、应用细胞毒抗体(如mAb84)、应用无病毒iPSC、植入经过预评估的安全的iPSC以及封装多能干细胞来源的移植物以防止其在移植过程中扩散。除以上方法外，还可在iPSC诱导层面尽量避免致瘤性的发生或提前发现成功诱导的iPSC的致瘤性。。最初的诱导过程需要应用具有致癌作用的转录因子以及慢病毒或逆转录病毒载体，而后者导入宿主细胞后并不是完全沉默的，存在一定的安全隐患。如前所述，很多重编码因子都存在癌基因，尤其是c—Myc。在iPSC的诱导过程中，Klf4和c-Myc在Lin28和Nanog的共同作用下是可替换的。有研究显示，可能仅需要Oct4和Klf4，甚至只需要Oct4便足以诱导iPSC。同时，为了研究出非病毒载体，也出现了各种各样的方法，如运用质粒载体、转座因子以及迷你环状DNA运载体等。Cho等发现，通过蛋白层面的重编码也能成功诱导iPSC，并不需要基因操控。在体外实验中，软骨组织工程能有效鉴别iPSC的异常分化途径，也就是说，能提前发现诱导的iPSC是否具有致瘤性而不需要将诱导细胞植入体内。这一发现为更安全地诱导和应用iPSC提供了振奋人心的新方向。


iPSC的诱导方法


目前，诱导iPSC遇到的2大难题是致瘤性和低诱导率。业已证实，有部分小分子能提高重编码的有效性和完整性，例如，组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸能使重编码效率提高100倍以上。Zhao等的研究显示，在Yamanaka 4因子(Oct4、Sox2、Klf4和c—Myc)诱导iPSC过程中加入p53 siRNAs能显著提高重编码效率。Nakagawa等的研究显示，c—Myc对于iPSC的诱导可有可无，但在重编码速度和效率方面起关键作用。这些研究结果使得在保证诱导的有效性和移植后宿主的安全性方面陷入了两难的困境，找到能平衡彼此的方法变得尤其重要。


四、结语


iPSC能直接从体细胞诱导而成，且具有多向分化潜能。与ESC不同的是，iPSC不需要取自胚胎，可避免ESC移植面临的伦理学问题和免疫排斥反应，因此有望成为治疗缺血性卒中的细胞来源。虽然移植的有效性仍有待进一步证实，但从目前在临床前试验中iPSC治疗脑缺血所取得的成效来看值得乐观。然而，要真正运用到临床，还存在几个关键问题需要解决。首先，iPSC能分化为多种细胞，为了了解其作用的具体方式，需要明确iPSC分化形成的哪些神经细胞与缺血性脑损伤直接相关；其次，iPSC移植的最大挑战在于其安全性，尤其是致瘤性，虽然目前已提出各种方案在诱导前、诱导中以及诱导后分别避免或抑制致瘤性的发生，但尚无确切的方案能确保无致瘤性；最后，恰当的移植方法能提高移植细胞在体内的存活率和进一步加强治疗效果，在选择移植方法时，除了需要更好地确定移植时间和途径外，还需要确定移植前的分化状态、移植剂量和移植辅助物。


iPSC诱导移植的研究仍处于初步阶段，其中的各种机制都不清楚。近期的研究表明，在同源受体内，iPSC分化的一些细胞异常表达基因能诱导受体产生T细胞依赖性免疫应答，这对于先前认为iPSC移植不会发生免疫排斥的观点提出了质疑。然而，鉴于最近有关iPSC研究的迅速进展，相信在不久的将来，iPSC移植用于临床治疗缺血性卒中有可能会成为现实。


来源：国际脑血管病杂志2014年11月第22卷第11期


作者：[根据相关法规进行屏蔽]南京总医院神经内科  李芸，杨恋，王昭君，徐格林，刘亚红