皮肤性病的实验诊断技术

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实验诊断技术
淋球菌实验室诊断
（一）概要
淋病的实验室诊断包括初步诊断和确证试验，常用的实验方法有:
初步诊断：涂片检查；培养检查；氧化酶试验。
确证试验：糖发酵试验；直接免疫荧光试验；SPA协同凝集试验；酶反应。
（二）涂片检查
1、方法 用无菌小棉拭或接种环取分泌物，轻轻滚动制片，自然晾干或稍加热固定，革兰染色，油镜下观察结果。
2、结果
急性淋病：细菌数多，常成对、双肾形排列，查到多形核白细胞内有吞噬的淋球菌（彩图6-1）则有诊断意义， 阳性检出率可达95%～99%。
慢性淋病：细菌数较少，多存在细胞外，可呈单个、四联、八叠状排列，阳性检出率很低，女性患者易假阳性。
3、注意事项 适用于急性淋病，不适用于慢性淋病病人，女性病人、直肠、咽部感染，不推荐用作判愈标准。
（三）培养检查
是目前世界卫生组织推荐的筛查淋病病人的唯一方法。
１、培养基
国内：血液琼脂、巧克力琼脂、添加抗菌剂。
国外：T-M培养基、NYC培养基、ML培养基。
２、培养条件 最适温度35～36℃，需氧，首次需5%CO2，保持一定湿度, 培养24～48小时观察结果。
３、菌落和菌体形态特征
菌落形态：圆形凸起，稍扁平、光滑、湿润、半透明或灰白色菌落，直径0.5～1mm，粘稠（图50-1），延长时间菌落可变粗糙。
菌体形态：菌落上的菌体大小、染色深度、排列方式不一致，25%为双球菌（图50-2），75%为单球菌、四联或八叠形。
４、注意事项
标本应即时接种培养，症状不典型男性病人应晨起排尿前或排尿后2～3小时后取材。一般不加万古霉素作抑菌剂。培养36小时菌落特征最好。
（四）氧化酶试验
１、原理：利用淋球菌产生的氧化酶与酶底物（盐酸四甲基或二甲基对苯二胺）作用产生紫红至黑色的颜色反应。
２、方法：将试剂直接滴在可疑菌落上或涂有菌落的滤纸上，变红色者为阳性，如保存菌种，应在变黑之前转种。
３、注意事项：注意与非淋菌性氧化酶阳性菌鉴别。试剂要新鲜，避光，冷冻保存。铁可使氧化酶试剂变红，出现假阳性。
（五）糖发酵试验
１、原理：淋球菌只产生分解葡萄糖的酶，分解培养基中的葡萄糖产酸，使PH下降，指示剂变色，并以此与其他几种奈瑟菌相鉴别。
２、方法：取培养18～24小时的菌株适量，混悬于0.5ml BSS（缓冲平衡盐指示溶液：磷酸氢二钾0.4g，磷酸二氢钾0.1g，氯化钾8g，酚红0.6g，pH为7.1～7.2，过滤灭菌后储存于4℃冰箱备用）中制成浓的菌悬液。取20%糖0.05ml加BSS0.1ml，每支糖发酵管加菌悬液0.05ml，混匀，37℃水浴4小时后观察结果，培养液由红转为黄色为阳性，淋球菌只发酵葡萄糖，不发酵其他糖。
３、注意事项：试验所用的糖和菌要纯。一般用对数生长期的菌（18～24小时）做试验。
梅毒实验室诊断
（一）概要
梅毒的实验室诊断包括病原体检查和抗体检查两个方面，抗体检查又分为非特异性和特异性抗梅毒螺旋体抗体两种。
（二）病原体检测
螺旋体有各种形态
１、标本采集
(1) 皮肤黏膜损害：暗视野显微镜可以检测一期和二期梅毒的皮损。理想的标本为不含血细胞的组织液。用等渗盐水浸湿的纱布小心地清洗皮损后，用干纱布或用钝的不锈钢刮刀轻轻地摩擦皮损并挤压使之产生组织液。将渗出液取出移至玻片上，也可以直接用玻片压印取渗出液。加一滴等渗盐水与渗出液混合成混悬液后加盖玻片，并立即检测或晾干后立即染色检查。
(2) 宫颈或**损害：取材前，用灭菌棉拭子擦取黏膜表面的分泌物，然后用接种环蘸取渗出液。必要时，用镊子挤压溃疡处，使其产生渗出液。其他步骤同皮肤损害取材。
(3) 淋巴结取材：消毒淋巴结表面的皮肤，用1mL无菌注射器配12号针头，吸取无菌等渗盐水0.25～5mL，以无菌操作穿刺淋巴结并注入盐水，再吸人注射器内。如此反复2～3次后，取少量的淋巴液直接注于载玻片上，加盖玻片后，立即置于显微镜检查。
２、暗视野显微镜检查法。
原理：光线由暗视野聚光器边缘斜射到载玻片上的液体和病原体上，由于折光率不同而显现出物体的形态。
方法：滴一滴蒸馏水于聚光器上，上升其与载玻片接触，用10倍、40倍物镜观察。
结果：查到发出亮光的具有典型梅毒螺旋体形态和运动方式的螺旋体为阳性。
３、姬姆萨染色
方法：轻刮皮损表面，至有血清渗出，用赶紧载玻片直接印片，自然晾干后，滴加3～5滴姬姆萨染液染30秒～1分钟，再滴加蒸馏水稀释(1:10)，湿盒放置过夜，水冲洗，晾干，油镜下观察结果。
结果：梅毒螺旋体染成淡紫红色。
４、Fontana, Tribondean镀银染色法
原理：梅毒螺旋体具有亲银性，可被银溶液染成棕黑色，在普通高倍显微镜下可观察到螺旋体的形态。
方法：涂片→用罗吉氏固定液固定→加鞣酸媒染液剂→加经氨处理的银溶液→加盖玻片以加拿大胶封闭，油镜下观察结果。
结果：螺旋体显棕黑色。背景则为淡棕色。
（三）血清学检查
１、非梅毒螺旋体抗原血清试验
原理：梅毒螺旋体一旦感染人体，宿主迅速对感染早期被损害的宿主细胞以及梅毒螺旋体细胞表面所释放的脂类物质作出免疫应答，在3～4周产生抗类脂抗原的抗体（反应素）。这些抗体主要是IgG和IgM型混合抗体，对机体无保护作用。未经治疗的患者，其血清内的反应素可长期存在。经适当治疗后，抗体可以逐渐减少至转为阴性，因此可用于疗效观察及判愈。目前梅毒的所有非螺旋体试验都是使用心磷脂、卵磷脂及胆固醇作为抗原。
方法：不同方法其抗原处理方法也不同，常用的有：VDRL（由0.03%心磷脂、0.21%卵磷脂、0.9%胆固醇制成抗原）、USR（用EDTA处理抗原，血清不需加热）、RPR（用碳素颗粒作指示剂）、TRUST（用甲苯胺红颗粒作指示剂）。以RPR法为例进行定性和定量检测（图50-5）。
RPR定性和定量试验：取50μL没加热的血清或血浆置试验卡片的环中，定量试验取1:2～1:16稀释的血清，均匀涂于圆圈内，再于每个标本中滴加l滴(20μL)抗原悬液；用手动或在水平旋转仪上，旋转反应卡片8分钟（100±5转/分），立即在光线下用肉眼观察结果。如阳性反应滴度大于l:16，若需测定最高反应滴度，则将血清继续稀释进行定量试验为弱阳性反应为止的滴度，即为最高滴度。
结果：阴性：卡片圆圈中出现小至大的黑色絮状凝集物。
阴性：卡片圆圈中仅见集中一点的碳颗粒。
结果及临床意义：
定性试验：用于梅毒筛查。
定量试验：用于疗效观察。早期活动性梅毒滴度1:8～1:16，最高可达128，早期梅毒足量治疗后，可在6～24个月转阴。转阴时间与治疗前病程成正比。复发或再感染时可转为阳性，滴度上升2个滴度。
假阳性现象原因：实验误差（温度、滴度、时间、试剂、PBS或生理盐水被污染）、自身免疫性疾病、急性发热性疾病（风疹、疟疾、水痘、传染性单核细胞增多症）、麻风、HIV感染。滴度<1:8。
假阴性反应原因：抗体过剩引起的前带现象。
血清固定现象：少数患者治疗后血清试验长期保持定性阳性(1:4)或弱阳性，而定量则为阴性，可能是由于患者体内的记忆淋巴细胞保持一定的抗体**能力，有时可终生阳性。
２、梅毒螺旋体抗原血清试验
原理：用梅毒螺旋体作抗原，检测特异性的抗梅毒螺旋体抗体。常用的方法有梅毒螺旋体血球凝集试验（TPHA）（图50-6）、明胶凝集试验（TPPA）和荧光梅毒螺旋抗体吸收试验（FTA-ABS）（图50-7）。
方法：按试剂盒说明书操作。
临床意义：
１、FTA～ABS试验特异性高，敏感性强，被认为是金标准。
２、TPHA试验用于梅毒确证试验，治疗前的敏感性，一期、二期、潜伏分别为76%、100%、97%。
３、TPHA阳性患者由于记忆细胞**抗体，治疗后可终生阳性，不作为疗效观察指标。
４、特异性试验很少出现假阳性，但有1%的生物学假阳性：红斑狼疮可使FTA-ABS呈假阳性；**增多症的嗜异性抗体可使TPHA呈假阳性；麻风病人的非特异性试验假阳性可达40%，特异性试验也可呈阳性。
沙眼衣原体实验室诊断
（一）概要
沙眼衣原体是衣原体属微生物，具有原体和始体(也称网状体)二个发育型,原体有传染性。
目前已知沙眼衣原体有15个血清型。不同型别可引起不同的疾病。血清型D～K型主要引起泌尿生殖器的感染，如尿道炎、宫颈炎和盆腔炎等。
衣原体的实验室诊断有直接镜检、细胞培养、抗原检测、核酸检测和抗体检测。临床上多采用直接镜检和抗原检测法。
（二）直接镜检
原理：沙眼衣原体在受累的细胞中增殖并形成包涵体，可用特殊染色检出。
方法：将临床标本涂片后，作姬姆萨染色、碘染色或巴氏染色，镜下观察。这是一种简便、价廉的诊断方法，可用于新生儿眼结膜刮片的检查，其敏感性约95%。但用于泌尿生殖道沙眼衣原体感染的诊断，敏感性和特异性较低。姬姆萨染色，油镜下衣原体包涵体为细胞内紫色或蓝色结构，而周围细胞浆为灰色。碘染色，衣原体包涵**于细胞浆内，染成深棕色。
临床意义：涂片中发现包涵体可诊断为衣原体感染，但涂片染色法敏感性低(40%)，临床较少采用。
（三）衣原体抗原免疫快速法
１、原理
应用带色乳胶标记的鼠抗衣原体LPS单克隆抗体检测标本中衣原体LPS抗原。敏感性和特异性与酶联法相似。操作简单，无需特殊设备。
２、方法
按常规方法取含柱状上皮细胞标本。将标本加提取缓冲液经80t水浴保温10～12分钟，使衣原体脂多糖(LPS)抗原释放。然后加5滴标本提取液到含有带色乳胶标记的鼠抗衣原体LPS单克隆抗体的测试卡检体窗中，作用15分钟。如标本中含有衣原体LPS抗原，可与上述标记的单抗结合，结合物通过毛细管作用移动到结果窗，并可被该处所含有的未标记的鼠抗衣原体PS单抗所捕捉，阳性结果在结果窗可见一条细线，过剩的未结合的带色乳胶标记的鼠抗衣原体LPS单抗可移动到质控窗，与该处的兔抗鼠抗体组合，显现一条细线。无论阳性或阴性标本都应在“质控窗”显示一条细线，表明试剂质量合格，试验步骤正确。
３、临床意义
此法诊断女性宫颈沙眼衣原体感染的敏感性为87%，特异性为98.8%。此法的优点是简易，方便，快速，尤其适用于基层单位。缺点是标本中需要足够数量的沙眼衣原体抗原。厂家仅推荐该产品用于诊断女性生殖道沙眼衣原体感染。
（四）免疫荧光检查
１、原理
应用荧光素标记的沙眼衣原体单克隆抗体与相应的抗原结合，在荧光显微镜下，阳性者可见到亮苹果绿的原体和网状体。
２、方法
(1) 将标本涂于玻片上。空气中干燥，滴0.5mL丙酮固定；
(2)标本片及阳性、阴性对照片各加30gL抗体试剂，涂匀；
(3)置于湿盒中在室温孵育15分钟。用蒸馏水冲洗，空气中干燥；
(4)加1～2滴封固液，覆以盖玻片在荧光显微镜下(1000倍)观察。
３、结果
阳性标本中可见到原体，为单个、针尖样大小、发出中等度到高强度的苹果绿色荧光的颗粒。对于泌尿生殖道标本，如果每片中原体数≥10个时，结果为阳性。少数情况下，在片中可见到比原体大2～3倍的衣原体颗粒，这可能是未成熟的衣原体原体、网状体。
４、临床意义
此法诊断沙眼衣原体感染的敏感性为70%～95%，特异性为83%～99%。但结果判断与观察者的经验有密切关系。
             支原体实验室诊断
（一）概述
支原体(Mycoplasma)是一类缺乏细胞壁，大小和结构介于病毒与细菌之间,能在人工培养基中
生长和增殖的最小原核微生物。在固体培养基上能形成特殊的油煎蛋样菌落。迄今已知的支原体有150佘种，寄居于人类的有16种，其中在泌尿生殖道中能分离出的有解脲脲原体(Ureaplasma urealyticum，Uu)、人型支原体(M.hominis,Mh)、生殖支原体(M.genitalium，Mg)和发酵支原体(M.fermentans，Mf)等8种。对人体有致病作用的有Uu、Mg、Mh和肺炎支原体。而Mpe、Mpi和Mf是人类免疫缺陷病毒(HIV)的协同因子，能促使HIV感染者较快发展成为艾滋病患者。
支原体可正常寄居于人体腔道的黏膜上，在机体免疫力低下或黏膜受损的情况下，寄居的支原体可发展成致病原。Uu有14个血清型，不同的血清型其致病作用也不同。
（二）培养检测法
取男性患者尿道分泌物、前列腺液、中段尿、**和女性患者宫颈分泌物或**深处分泌物标本，立即接种于Uu或Mh液体培养基中，置37℃温箱中培养48～72小时观察结果。培养基由淡黄色变为透明红色为阳性。
（三）临床意义
支原体是NGU的常见病原体，但健康者也可携带，因此应结合临床表现来确立诊断。支原体个体很小，在液体培养基中生长不呈混浊现象。如培养液混浊变红时，应重新处理后再检查。