异位成骨动物模型的研究进展

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近年来随着骨组织工程学的迅速发展，应用骨组织工程技术治疗骨缺损为当前发展趋势，异位成骨动物模型相对于原位成骨可以减少实验中影响成骨的变量，能评估成骨干细胞、成骨诱导材料的效果。异位成骨动物模型的建立方法从最早的皮下和肌肉小袋植入模型，到后来的肾被膜植入以及腹腔内植入模型，各有特点，选择一个合适的模型对实验的成功有着密切的关系。本文将对异位成骨动物模型的研究进展作一综述。

皮下植入模型

皮下植入模型操作方法简单，应用最为广泛。模型可选择的动物大到猪、犬，小到兔、大鼠、小鼠，目前应用最广泛的是鼠类。皮肤切口的选择在背部，不仅植入空间大，而且鼠不容易触碰到伤口的缝线，有利于切口愈合，若行对照实验，可在背部对侧皮下植入作为对照。

Kasten等为比较修饰后生长分化因子5(GDF－5)与原生GDF－5及骨形态生成蛋白2(BMP－2)的成骨能力，将分别含有修饰后GDF－5、BMP－2以及原生GDF－5的磷酸三钙材料植入24只小鼠背部皮下区域，4周后测量ALP含量比较早期成骨情况，得出修饰后GDF－5与BMP－2成骨能力差异无统计学意义，但均优于原生GDF－5的结论。考虑到小型猪的骨再生率与人类接近，Metzler等选择35只小型猪为实验对象，切口选择在猪的椎旁皮下区域，用以模拟人类骨再生模型比较富血小板血浆(PＲP)对植入牛属羟基磷灰石(bHAP)、藻类羟基磷灰石(pHAP)、生物玻璃(BG)骨替代材料成骨效果的影响，结果提示PＲP对bHAP及pHAP成骨能力提高显著，BG实验组及对照组均未见有异位成骨出现。骨髓间充质细胞(BMSCs)作为一种多能干细胞是经典的植入细胞，但单纯干细胞植入效果往往不佳，尤其在皮下植入模型，所以常常联合羟基磷灰石、磷酸三钙、聚己内脂等支架材料和BMP等细胞因子加以诱导，Noshi等将多孔羟基磷灰石材料(HA)、HA/BMP、HA/MSCs及HA/MSCs/BMP分别植入大鼠皮下，结果显示HA和HA/BMP组未见类骨质形成，HA/MSCs组在植入4周后可见新生骨出现，而HA/MSCs/BMP组则在2周后即可见明显的新骨生成，4周后新骨形成量及范围更大，提示三者联合使用能够更大程度地促进诱导成骨。

采用皮下植入模型的一个缺陷是由于皮下组织松弛，植入物有游离的可能，尤其在使用大型动物且时间跨度长的实验中更容易发生。成骨产物与周围组织外观类似使产物更难分辨，进行适当的标记可以有效解决此类问题。解芳等采用荧光染料CM－Dil标记BMSCs与TCP复合植入比格犬背部皮下，8周后取材行组织学检测，HE染色后可见支架孔隙中有类骨基质沉积，使用荧光显微镜可观察到标记细胞的存在。此外皮下植入异位成骨相比于其他部位异位成骨模型在成骨能力上较差。

Yoshida等通过比较在20只Wistar大鼠的皮下与肌肉内分别植入以I型胶原为载体的rhBMP－2的成骨情况，在术后1、3、7、21d测量皮下与肌肉的碱性磷酸酶及钙含量评估初期成骨，结果显示术后第7、21d肌肉的碱性磷酸酶与钙含量均高于皮下，提示皮下的成骨环境要差于肌肉内。这种差异的产生一般认为是皮下的氧压、血供即细胞生长环境不及肌肉，此外肌肉本身含有未分化成骨干细胞，在成骨环境中容易分化为成骨细胞诱导成骨，而皮下则缺乏此类细胞。然而，也有学者观察到相反的结果，Gotz等将羟基磷灰石支架植入于哥廷根小猪的皮下和肌肉中，在植入10周，4、8个月后经组织学测量显示植入皮下的新生骨构成比要比植入肌肉的多，提示皮下植入成骨要比肌肉明显，但作者考虑可能是羟基磷灰石颗粒在肌肉中的生物力学作用抑制了异位成骨的形成所致。有学者研究发现即使不加入干细胞，仅植入成骨诱导因子及支架也可以诱导成骨，考虑可能是由于皮肤损伤可以导致循环内皮祖细胞的聚集所致。

肌袋植入模型

肌袋植入模型应用于犬、山羊、兔子等动物的研究较多。体型较小动物植入部位的选择大多在后肢的大腿或臀部肌群处，而在犬、山羊等大型动物，则多选择背部，竖脊肌、斜方肌常为植入部位。Wang等为研究羟基磷灰石支架多孔结构的成骨能力，选择2岁龄的犬为研究对象，在背部T8～L5处作一脊柱旁平行切口，暴露肌肉并钝性分离出数个肌袋后植入支架材料。肌袋植入成骨技术成熟，在人体也有着临床应用案例，Warnke等在2004年使用计算机3D打印技术模拟出患者缺损的下颌骨模型，将钛网制成相匹配的支架，进而将含有骨矿石、自体骨髓和骨形态生成蛋白－7(BMP－7)的钛网支架植入患者的背阔肌，4周后进行放射性元素锝99骨扫描和胸部CT检查，结果均提示在植入部位有骨组织形成，7周后成功诱导成骨并进行游离骨皮瓣手术修复了下颌骨缺损，术后4周患者可以进行少量咀嚼活动。

Heliotis等在未使用骨髓或成骨干细胞情况下，仅将羟基磷灰石支架和BMP－7植入患者左侧胸大肌内，3.5个月后经锝99骨扫描提示在支架区域内可见骨生成，6个月后将获得的成骨组织移植于患者左下颌骨进行替代，行组织切片检测显示骨含量达17%。骨骼肌中存在2种成体干细胞类型:骨骼肌卫星细胞和肌源性干细胞，体内外实验均显示这2种干细胞在一定环境条件下具有分化成肌、骨和脂肪组织的能力。Lai等利用胶原载体和人类重组骨形态生成蛋白－2在未加入干细胞的情况下，成功地在大鼠骨骼肌袋中诱导成骨，表明肌肉内存在干细胞，并可被诱导分化成骨。

但Hao等分别将多孔磷酸钙材料(pCPC)及多孔磷酸钙复合山羊牙髓干细胞(SGDs－pCPC)植入山羊背部肌袋分组，在2、4、6、8周后未加入干细胞的pCPC分组中并未检测出新生骨，而SGDs－pCPC分组第2周开始即见少量类骨组织出现，且随时间增加类骨组织更多，同时可见血管样物质生成。可能是不同的支架植入及未有成骨细胞因子的应用导致了相反的实验结果。但同样因为肌肉组织内富含成骨干细胞所以在相同的诱导条件下能够得到更多的成骨量，且骨骼肌内血运丰富，更有利于细胞的增殖，因而成骨能力强。Yang等在以猪和狗为实验对象上的研究显示在肌肉内异位成骨45d即可被组织学上观察到，而皮下植入成骨则需要60d。需要注意的是有研究显示当肌肉损伤后，BMP信号通路会上调。在应用肌袋植入模型时，BMP信号的上调会促成骨因素的产生，可能影响研究结果。因此钝性分离肌肉，避免肌纤维的损伤可以较大程度避免该因素的干扰。

肾被膜植入模型

肾被膜植入模型因为其操作的复杂性所以在实际应用中并不广泛。模型一般使用鼠类，在其肾被膜处钝性分离出一小袋状，将植入物放入。采用袋状放置植入物，考虑可以一定程度避免植入物的移位、游离。要注意保持肾被膜的完整性有利于确保植入物放置在位且可促进成骨血管化。此外还有用穿刺的方法直接将细胞打入肾被膜内，但成功率较开放植入降低。王娟等将人脐带MSCs注射到BALB/c裸鼠肾被膜下，3个月后人脐带MSCs仍为梭形排列，未见类骨质，无明显淋巴细胞浸润，可能系植入干细胞的密度稍低所致。

肾被膜植入模型的一个优势在于此区域血流丰富，因而植入物相比于血运营养少的皮下更易成活，细胞增殖快，实验的时间跨度也可以较短，更易形成血管化，植入体在被血管化后，才能继而自体化，与自体组织相容。有文献报道植入肾被膜区域的组织和器官有免疫隔离作用，发生免疫排斥反应少，可以被称为免疫赦免区，是异体成骨培养的良好场所。此外，因为肾被膜区域几乎没有成骨干细胞，因而当植入后有成骨，则几乎可以肯定的认为成骨产物是由植入物分化或增殖而来，避免了内源性干细胞对实验的干扰。当然，肾被膜植入模型也有局限性，因为实验动物一般为鼠类，小鼠的肾被膜组织薄，容易破裂，植入物可能游离于腹腔内，造成实验失败。且若植入小鼠肾被膜中，植入物的尺寸会受到限制，目前肾被膜植入异位成骨模型大多用于牙胚组织的研究。Zhang等为研究含rhBMP－2的β－TCP支架对牙组织形成的作用，将牙胚细胞及含rhBMP－2的β－TCP支架植入大鼠的肾被膜下，与仅植入牙胚细胞和仅植入支架的大鼠进行对照，得出了含rh-BMP－2的β－TCP支架对牙组织形成有诱导作用。

腹腔内植入模型

腹腔内血运丰富，适宜细胞生长，空间广泛成骨量大，植入操作步骤不复杂，并且将材料植入体腔内壁层腹膜、腹腔大网膜等延展性可能更好、临床适用性更强，因而腹腔是不错的异位成骨植入部位。但目前关于此方面的研究报道仍然较少，可能是腹腔内强烈的免疫排斥反应限制了其应用。Duailibi等将牙胚细胞及支架材料植入近交系Lewis大鼠网膜内模拟牙组织体内发育过程，12周后成功得到牙齿组织。近交系可以一定程度上避免排斥反应，但是近交系动物实验成本高，难以满足大样本的实验研究。

于金华等将封闭群SD幼鼠牙胚分别植入SD成年鼠的肾被膜下、肠系膜内、腹膜外间隙、腹腔内和口腔黏膜下进行比较，3周后发现仅在肾被膜下及肠系膜内牙胚生长分化良好，在腹膜外间隙和腹腔内发现有大量淋巴细胞浸润，他们认为可能系因为该处同种异体移植物免疫排斥反应严重导致。而黄鹏等在狗的腹腔内大网膜下植入羟基磷灰石多孔材料并未见骨细胞生长，考虑是因为网膜包裹了支架不利于组织液的进入和血管的生成，且网膜可能过滤了血液中的某些成骨成分导致成骨诱导效果不理想。既往研究中，也有学者未观察到免疫排斥反应发生，Shin等考虑到网膜内区域血液丰富，为构建血管化骨组织，将新生鼠MSCs与静电纺丝多孔材料支架植入大鼠网膜内，4周后取植入部位组织进行组织切片、免疫组化以及扫描式电子显微镜检测，结果均提示有类骨组织贯穿整个支架。

讨论

异位成骨模型在骨组织工程学的研究上有着十分重要的地位，目前皮下植入，肌袋植入、肾被膜下植入异位成骨模型技术已经相对成熟，各有其优缺点，腹腔内异位成骨模型还有待进一步研究。未来将进一步建立理想的异位成骨动物模型，为新材料的动物实验验证提供更为可靠的依据。

来源：中国矫形外科杂志2015年3月第23卷第6期