【ASH2014】CRA-T治疗技术在B细胞肿瘤中的研究进展

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    作者单位：河北燕达医院  陆道培血液？肿瘤中心嵌合型抗原受体T细胞（chimericantigen receptor T cell, CAR-T）是通过基因改造后获得靶抗原单克隆抗体单链可变区（scFv）的T细胞。CAR-T通过抗原抗体结合的原理特异性识别肿瘤细胞表面的抗原，因此无主要组织相容性复合体（MHC）限制性，还可以避免因肿瘤细胞MHC下调或丢失导致的免疫逃逸。而且通过在嵌合基因设计时增加共**分子信号，可增强CAR-T细胞的肿瘤杀伤活性。经过20多年的发展，CAR-T的设计已经越来越完善，手段也越来越多。
    大量基础研究及临床试验证明，CAR-T在血液肿瘤领域具有巨大的应用前景，成为近年来免疫细胞治疗的最大热点。各大制药公司及生物公司也纷纷加入CAR-T的研发与临床转化大潮。2014年12月，第56届美国血液学会（ASH）年会在旧金山召开。免疫细胞治疗尤其是CAR-T免疫治疗是本次ASH会议的热点话题之一，来自全球的多个研发中心报告了CAR-T的试验结果。
    【CAR-T在B细胞肿瘤中的应用】
    经过近26年的研究，CAR-T技术已经发展出三代。第一代CAR-T在细胞内只有1个T细胞CD3C受体的信号区；第二代在第一代基础上增加了1个共**分子信号；第三代则在第一代基础上增加了2个共**分子信号。第一代CAR-T在体内存在时间太短且临床效果不佳，第三代CAR-T已被用于套细胞淋巴瘤（MCL）及滤泡非霍奇金淋巴瘤（NHL）临床试验，但其并未显示出比第二代更优的临床结果。
    目前在血液肿瘤临床应用上较为成功的主要是第二代CAR-T技术，转染的共**分子主要是CD28或 CD137（4-1BB）。CD137-CAR-T比 CD28-CAR-T 具有更强的存活能力及扩增能力，CD137共**信号主要产生中央记忆CAR-T,CD28共**信号主要产生效应记忆CAR-T.含CD137结构域的CAR-T能在慢性淋巴细胞白血病（CLL）或急性淋巴细胞白血病（ALL）患者体内分别存在3年多或2年多，增殖能力甚至达到10万倍。携带CAR编码基因的载体主要是反转录病毒或慢病毒。对反转录病毒的长期观察发现其在临床使用相当安全，而慢病毒的转染效率更高且能传递大片段DNA序列。
    选择合适的肿瘤抗原作为靶标是设计安全有效CAR-T的关键。由于CD19仅表达于各分化阶段的正常及恶性B细胞而不表达于其他非B细胞（如造血干细胞等）表面，因而CD19-CAR-T被广泛用于B-ALL、B-CLUMCLNHU多发性骨髓瘤（MM）等恶性B细胞肿瘤的临床试验，相关研究进展在本次ASH会议均有报告。尽管如此，仍有5%——10 %的患者因丢失CD19 抗原而逃避CD19-CAR-T的识别与杀伤。因而还需要开发其他肿瘤抗原作为CAR-T的靶标，或联合应用多种靶标的CAR-T以避免肿瘤细胞的免疫逃逸。
    【第56届ASH会议报告中CAR-T技术的主要进展】
    在本届ASH会议中，CAR-T的相关报告主要聚焦于血液肿瘤临床应用中的技术优化及临床试验的改进，主要包括以下进展：（1）多个中心尝试开发通用型CAR-T,即釆用正常第三方细胞来源的T细胞。通过敲除内源性TCR基因以排除同种异体TCR导致的移植物抗宿主病（GVHD），且能进一步提高CAR-T的杀肿瘤效率。这种策略显著拓宽了CAR-T的细胞来源，避免因患者自体T细胞因数量低、功能不充分、扩增能力差等限制应用。第三方细胞来源的CAR-T还具备易于操作、重复性好等优势，更有利于大批量临床应用。（2）以往的研究报告更多用自体CAR-T联合化疗降低肿瘤负荷，以提高缓解率。而本次ASH会议上，Kebriaei等报告了在同种异体造血干细胞移植（allo-HSCT）后复发的患者中，通过供者CAR-T清除免疫残留的探索及其应用意义。allo-HSCT后回输供者的CAR-T可有效防止白血病复发，并避免了自体肿瘤细胞污染。而且供者来源的未转染T细胞还能清除受者体内丢失了CD19抗原的肿瘤细胞，可防止因肿瘤抗原逃逸导致的复发。（3）对于CAR-T临床应用的安全性，目前的主要策略是改用非病毒载体改造CAR-T,及通过**基因控制CAR-T的过度扩增及严重不良反应。本届ASH会议报道的非病毒基因转染方式包括睡美人（SB）转座子系统和mRNA转染。**基因已有多种，可诱导的Caspase9转基因（iCasp9）是目前较理想的**基因，它无免疫原性且能在24h内引起95 %以上的转基因细胞快速凋亡。iCasp9介导的细胞凋亡可由小分子二聚体AP1903触发，具有很强的可操作性。（4）目前报道的CAR-T临床前或临床试验都是用成熟T细胞改造成的CAR-T,通常在体内持续时间短，而限制临床效果并易导致肿瘤复发。几个研究中心开始探索将造血干细胞基因修饰成CAR-T的可行性，这种CAR-T可持续存在于体内（可达35周）并可分化成多系别靶标特异性的免疫细胞。在HSCT过程中釆用这种CAR-T尤其有利。（5）其他一些新策略的报道，如能产生双特异性衔接分子的CAR-T（ ENG-CAR-T），通过持续产生抗CD19及抗CD3同时募集B系肿瘤细胞和T细胞。这样不仅可利用CAR-T直接杀伤脾瘤细胞，而且募集的T细胞也有抗肿瘤作用。ENG-CAR-T比直接输注半衰期短的双特异性抗体具有更强、更持久的抗肿瘤作用。（6）针对单个靶标的CAR-T治疗时肿瘤复发或无效问题，一些中心开发出多靶标的CAR-T,临床前实验显示出更强的抗瘤效应。CD123可能是难治复发B-ALL的又一个重要肿瘤靶标。在临床前实验中，CD123-CAR-T对CD19-ALL小鼠显示出强大的抗肿瘤作用。联合CD19-CAR-T及CD123-CAR-T治疗B-ALL可能会有更好的效果。
    【CD19-CAR-T治疗B细胞肿瘤的临床试验进展】
    目前临床试验最成功应用的仍然是CD19-CAR-T治疗B细胞肿瘤。不同的B细胞肿瘤类型、CAR-T设计、基因转染方式、扩增培养技术、化疗方案等致使不同研究中心报道的临床试验结果不同，目前尚难有统一的标准和结论。
    美国**癌症中心利用反转录病毒转染的19-28ZCAR-T治疗了30例不同类型的B细胞肿瘤。在27例可评估的患者中有22例获得完全缓解（CR）或部分缓解（PR），最长的CR持续了37个月。该中心在本次ASH会议上报道了他们的最新进展：通过减低化疗剂量联合CAR-T治疗9例化疗耐药的弥漫大B细胞淋巴瘤，获得1例CR、4例PR、2例预后差的临床结果，且9例患者均未产生明显的不良反应。提示低剂量化疗联合CAR-T对进展性B细胞淋巴瘤有可能成为标准治疗方案。
    美国斯隆-凯特琳癌症中心用自体19-28ZCAR-T治疗了16例难治复发的B-ALL,其中88%的患者获得CR.大部分患者通过CAR-T治疗后为allo-HSCT创造了条件，甚至对移植后复发的Ph+-ALL也有效。宾州大学在本次ASH会议上报告了利用慢病毒转染的19-CD137ZCAR-T治疗B细胞肿瘤的最新临床结果，共治疗了20例儿童及成年人难治复发的B-ALL,CR率达到90%,6个月无病生存率和总生存率分别为67%和78%.
    根据各中心的临床试验，目前可得出下列几点经验：（1）患者在CAR-T治疗前应用化疗降低肿瘤负荷；（2）第二代CAR-T比第一代效果好；（3）ALL对CAR-T的应答比CLL好；（4）应答强的患者常发生严重的细胞因子风暴；（5）CAR-T的剂量与应答的程度无明确关系；（6）起多台肿瘤负荷与CAR-T的应答似乎无相关性，但骨髓有明显肿瘤浸润的淋巴瘤患者更易获得缓解。尽管CAR-T在血液肿瘤的临床试验中已经取得了不错的成绩，但要真正用于临床还有一些难题需要解决。
    【CAR-T技术存在的问题及展望】
    CAR-T技术在难治复发B-ALL和CLL、NHL、骨髓增生异常综合征（MDS）等血液肿瘤的治疗方面已显示出良好的潜力，已成为目前唯一有希望根治恶性血液病且不依靠allo-HSCT的新型技术，也是连接移植的重要桥梁或移植后清除残存肿瘤细胞的重要***。但这种技术仍然存在一些问题需要进一步探讨：（1）还需要更长的时间观察病毒载体是否会带来有害的插入性突变；（2）CAR-T的临床应用会导致严重不良反应，包括on-target效应（主要有肿瘤溶解综合征、细胞因子风暴、巨噬细胞综合征、神经毒性、B细胞缺如及低丙种球蛋白血症）及off-target效应；（3）CAR-T的临床试验结果各个中心结果不一，目前还处于探索阶段，很难达到统一的标准化治疗；（4）CAR-T的设计及培养制备成本过高。
    已有一些研究尝试解决上述问题，如用细胞因子阻断抗体中和细胞因子风暴，通过输注丙种球蛋白补充B细胞缺乏等。相信通过全世界研究者的努力，必定能优化出更安全、有效的CAR-T技术，让这项技术造福于恶性血液肿瘤患者。