【转贴】乙型肝炎病毒基因定量检测技术

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一、分子杂交定量分析技术
    (一)分支链DNA信号放大技术（bDNA）
    1987年美国Chiron公司Urdea等人报道，分别以微反应板和琼脂糖珠为载体，定量检测乙型肝炎病毒基因组[1]。在他们的定量检测系统中，采用了一种人工合成的、结构如同树枝的DNA信号放大探针，分支链DNA（branched DNA）因此而得名。
    bDNA系统的组成成分是数组相关的人工合成寡脱氧核苷酸。第一组探针是捕获探针，它的5“端标有生物素，可与已预先包被在微量反应板(或琼脂糖珠子)上的亲和素特异结合。理想地，该探针结合后可以竖直地牢固吸附于板孔或珠子的表面(目前已不再使用珠子)。这与以往将捕获探针“平躺”于板孔表面的方式不同，它可以最佳地发挥“捕获”(或杂交)能力。第二和第三组探针分别有12和36套，可与HBV-DNA分子组成夹心结构，每套探针都分别由两个部分组成。第二组所有探针3“端20个寡核苷酸(20nt)序列与捕获探针互补，其余30个左右寡核苷酸序列不一，分别与HBV DNA上不同区域互补。第三组探针与第二组相似，在杂交过程中，一段与靶分子特异结合，另一端则与放大探针互补。放大探针，即分支链探针，一级结构呈钗状或疏状，在钗柄，即主链的一端连接了45根由18个寡核苷酸组成的分支链，主链的其余部分则是可与第三组探针互补的序列。第五组探针与第四组探针的分支链互补，它的一端用碱性磷酸酶(AP)修饰。信号检测则是通过AP酶促化学发光的原理，从发光信号的强弱判定待测标本中HBV DNA含量，同时设定克隆的HBV DNA作参考标准。
    信号放大探针是bDNA系统的核心，其制备过程比较复杂，步骤包括枝链和主链寡脱氧核苷酸的化学合成，支、主链的连接，及连接后产物的纯化。bDNA系统的信号放大倍数可由第三组探针的根数(36)与放大探针上枝链数(45)的乘积求得（3645=1620）。另外，发光技术的敏感度比AP直接加底物显色后的OD值又放大了数十至数百倍。因此，一个HBV DNA分子信号可以被放大数万倍。
    目前已有数家医院引进bDNA试剂盒和配套的荧光分析检测仪，用于研究和满足特殊病人的需要。由于成本过高，bDNA技术在现阶段尚难以在国内成为常规检测手段。
    （二）微反应板酶联夹心杂交定量检测技术
    该技术由缪晓辉等发明[]。检测系统包括特制微反应板、捕获探针、夹心探针、信号放大探针，以及显色试剂等。该技术由许多独特之处，简要介绍如下：
    1．微反应板和捕获探针  所采用的微反应板的板孔表面覆盖了含由NOS基团的化学物质，该基团可以特异性地结合游离氨基。因此，人工合成的、一端标记了氨基的寡核苷酸探针可以被牢固地和竖直地“包被”在微反应板上，同时由于捕获探针上的氨基与寡核苷酸链之间以6-12个分子的碳臂连接，增加了捕获探针的活动度，提高了“捕获”能力。仅这一点就比传统的微反应板核酸杂交方法优越：第一，传统的方法是将待检测的目的基因直接包被在反应板上，而且是靠物理吸附，故吸附量有限。第二，吸附到板上的核酸容易脱落，影响到灵敏度和稳定性。第三，待测核酸“平躺”在板孔表面，无活动性，降低了信号检测探针的结合能力。由于上述原因，这种方法一直没有被广泛应用。
    2．夹心探针  根据HBV全基因序列，在电子计算机利用软件设计了两组共48根寡核苷酸探针，长度为28-33nt的。第一组夹心探针共10根，每根探针的3’端外加了20nt的序列，籍此与捕获探针连接；第二组夹心探针共38根，在他的5’端也外加了20nt的序列，籍此与信号放大探针连接。这样两组夹心探针，不仅覆盖了HBV全基因约1/3的序列，同时还靠两端的外延部分连接捕获探针和信号放大探针，起到了牢固“捕捉”HBV基因的作用。另外，由于夹心探针系寡核苷酸结构，杂交参数易于控制，与靶核酸结合的特异性强、稳定性好。还有，夹心探针均为人工合成，方便、价廉、稳定、易得。
    3．标记信号放大探针  这是本系统的关键成分，已申报国家发明专利。如前所述，bDNA技术所采用的信号放大探针是人工合成后连接而成，制备工艺十分复杂，造价也很高。我们制备的信号放大探针是一种部分单链的DNA结构，其单链部分长20nt，与第二组夹心探针互补，双链部分掺入了生物素，用于信号检测，双链长度可以在一定范围内任意调整，掺入生物素的数量也可以在一定范围内调整，因此信号放大的倍数也能够适当调整。标记信号放大探针的制备工艺上十分简单，耗材不多，有许多优越之处为bDNA所不及。
    4．检测过程  与bDNA十分相似，但我们采用酶联技术检测信号，无须昂贵的荧光检测仪，任何实验室都可开展。检测过程包括以下几个步骤：①包被：将捕获探针加入反应孔，置37℃2小时，或4℃过夜，然后再与第一夹心探针杂交，备用；②标本处理：待测血清用蛋白酶裂解并使HBV DNA解链后即可用于检测；③加样和捕捉目的基因：将处理后的标本与第二夹心探针一起加入反应孔，在一定温度下杂交6小时左右（亦可过夜）；④信号检测：首先将信号放大探针与第二夹心探针连接（杂交），然后用碱性磷酸酶标记的链亲和素与标记探针上的生物素发生连接反应，最后用碱性磷酸酶的底物显色，根据显色强度判断目的基因含量。
    5．质控指标  ①灵敏度:最低检测限为0.1pg/孔，即2pg/ml，但实用的定量检测范围为20pg-2ng/ml。与bDNA技术比较：bDNA检测阳性的血清标本，本方法的阳性检测率为90%；与PCR方法比较：PCR阳性标本（检测低限为10fg/ml）用本法检测的阳性率为50%左右；与膜斑点杂交法比较：斑点杂交阳性的28份标本，本方法检测均为阳性，但有5份HBV DNA含量较低的血清标本，采用微反应板酶联杂交法阳性，而斑点杂交法阴性；②精确度：批内变异系数为12.33%，批间变异系数为7.81%；③特异性:分别与多种克隆载体DNA以及HCV cDNA及蚊虫基因库cDNA，均未检测到阳性信号。30份献血员血浆标本、10份正常人血清标本以及30份乙肝病毒感染、HBV DNA PCR法检测阳性的血清标本均为阴性。
    微反应板酶联杂交法特异性强、灵敏度较高、操作简便，多个参数与bDNA相似，但明显优于膜斑点杂交法。目前正在研制微反应板酶联杂交法的试剂盒，近期可望问世。     (三)放射性同位素标记探针液相分子杂交技术
    美国的Abbott实验室和芬兰的Orion公司分别建立的HBV DNA定量技术均属于放射性液相杂交法[5,6]。其基本原理是用同位素掺入法制备的标记探针，与待检HBV DNA在液相中杂交，然后经过吸付洗脱或过柱洗脱，分离游离和结合探针，测定结合探针部分的放射活性。但两种方法有一定区别。Orion公司的液相杂交系统中含有捕获探针，该探针的一端连接了生物素[6]。捕获探针和同位素标记探针与HBV DNA一起在管内杂交一定时间后移入微量反应孔内，籍捕获探针上的生物素与微孔板预先包被的亲和素结合，再用洗涤液洗去非特异结合探针和游离的未杂交标记探针，然后用碱变性解链，将已杂交上去的标记探针连同目的基因一起与捕获探针分离，从而又把标记探针从板上解离出来，测定解离液中的放射性，参考已设的标准品cpm值，求得待检标本中HBV DNA含量。Abbott公司的产品，在将游离标记探针与已杂交的结合标记探针分离的方式上与Orion公司产品不同[5]，他们将管内液相杂交后的反应物，加到Sepharose基质中，通过分子筛效应，洗脱出分子量远远大于游离探针的杂交体，计数洗脱液中的放射活性，再与标准曲线对照。
    (四)双抗体夹心杂交法
     这是由英国Murex Diagnostics Ltd发明的HBV DNA定量检测技术(文献上多称之为Digene系统)[7]。该技术采用两种抗DNA/RNA杂交体的抗体：一抗为捕获抗体，直接吸附在微孔反应板上，二抗是偶联了AP的标记抗体，通过酶促化学发光反应检测DNA/RNA杂交体的信号。真正的核酸探针是RNA，它能特异地与HBV DNA基因组负链互补。该技术看似简单，但由于同时涉及免疫学技术，包括抗体制备过程，以及核酸探针制备技术，在现有的杂交定量分析技术中并无特殊的优越性

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二、PCR基因定量技术
    PCR技术的灵敏度很高，检测HBV DNA的低限可达到数千乃至数百个拷贝，为分子杂交技术望尘莫及，分子杂交技术的灵敏度很难达到1pg/ml以下的检测水平[9]。但是从定量角度看，分子杂交技术的精确度优于PCR法。由于技术本身的一些局限性，只有设置了内参照的竞争PCR才是最可靠的PCR定量技术，也是今后的发展方向。
   

      内参照是决定分析系统是否可靠和稳定的关键因素[11]。如何设计和制备内参照是最受研