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生化试剂应用常见问题的探讨
作者：张平 胡晓艳 李琳
作者简介：张平，男，学士，副主任技师，主要从事临床生化检验研究。
作者单位：云南省曲靖市第一人民医院

       试剂空白吸光度是反应试剂质量的指标之一，但不能反应试剂质量的全部。试剂成份、纯度、用量及稳定性，才是保证试剂质量的关键所在。目前市售的一些试剂具有抗干扰作用，主要是通过加入抗干扰物质或使用新的色素原以避免内源性物质的干扰。但值得注意的是：一些试验项目在消除内源性物质干扰的同时，会带来样品含量真实性的变化。

       1、试剂空白

       试剂空白吸光度是反应试剂质量的指标之一。每种试剂都有一定的空白吸光度范围，试剂空白吸光度的改变往往提示该试剂的变质；如利用Trinder反应为原理的检测试剂会因含酚类物质被氧化为醌而变为红色。碱性磷酸酶、r一谷氨酰转肽酶、淀粉酶等检测试剂会因基质分解出硝基酚或酚基苯胺而变黄。有些试剂久置后变浑浊。这些情况均可使空白吸光度升高。丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶等负反应，在放置过程中其试剂空白吸光度会因NADH自行氧化为NAD+而下降。原则上，吸光度上升的反应，其试剂空白吸光度越低越好，不能超过一个高限；相反，吸光度下降的反应，其试剂空白吸光度不能低于一个低限。因此，试剂空白吸光度限值，常作为程序参数输入仪器，如经核查超限，仪器会自动报警，提示更换试剂。需要指出的是，还原型辅酶I(或II)等投料量不足或劣质的原料，往往需要加大用量，才使“表观”吸光度上升，凑合过试剂空白核对的“关”，其后果为如下情况：

       1．1 线性范围变窄 现象：高值测不高。原因：生产试剂时有效成分投料量不足；试剂成份稳定性较差。
       1．2 灵敏度变低现象：酶促反应速度曲线斜率下降，测定结果有严重系统误差。原因：试剂底物浓度不足。
       1．3 低值偏高 现象：试剂空白的变化曲线(吸光度VS时间)明显波动。原因：试剂自身不稳定，自行分解；工具酶纯度不够，杂酶含量超限，导致干扰作用。

       2、样品信息

       样品的溶血、脂血、黄疸等会对测定结果产生非化学反应的干扰。因此，应根据溶血、脂浊、黄疸的光谱吸收特性，采用双波长或多波长的检测模式，并在结果计算中扣除因溶血、脂血、黄疸引起的影响，减少干扰程度。

       3、测定范围

       每种待测物都有一个可测定的浓度或活性范围，样品结果若超过此范围，分析仪将显示结果超过范围的提示。表示试剂已经变质，应更换合格试剂。

       4、底物耗尽

       使用连续监测法、两点法测定酶活性时，若酶活性非常高，底物接近被耗尽，吸光度上升或下降会超过某一吸光度变化范围，监测期的吸光度将偏离线性，使测定结果不可靠。

       5、酶的预活化

       测定血清中的某些酶，如CK，离体(采血)后很容易失活。失活的原因是酶活性中心的活性基因巯基(一SH)被氧化造成的。只有通过适当的还原作用才能重新激活。如CK—NAC试剂盒即含有CK活化剂，名为N一乙酰半胱氨酸。实验研究证明，NAC对血清中已失活的CK活化过程约需180 S。这就是CK测定为什么要延迟时间较长的理论依据。在AST，ALT采用IFCC推荐方法测定时需要磷酸吡哆醛预活化。需要强调：含有活化剂的生化试剂，其测定酶活性的结果要高些。

  6、校准与结果溯源性

       酶的校正：要满足在同一方法学、同一测定条件、与理论计算的FACTOR值差异不大，没有发现有明显影响因素，方可进行校正。

       检验结果溯源性，得建立一个可靠的参考系统作为准确性基础，然后将准确性转移到常规方法测定中去，使常规方法测定结果可溯源到参考系统所提供的准确性基础上来。在实现溯源性目标过程中，永远以患者新鲜标本为实验对象，以方法学对比试验方法为验证手段。方法学对比试验常采用回归方程进行统计分析，假如斜率接近1，截距较小，这意味着实验室常规方法对标本测定结果和溯源目标参考系统对标本检测结果非常接近。

       临床化学中参考标准(二级标准)要有通用性，但生产厂家提供的校准液并非通用的，只适用于某一特定的分析系统。

       校准液标示值往往是按其基质偏差修正的，所以标示值并非实际值。校准液、质控血清通常是经过处理的混合人或动物血清，这种制备物在特定分析系统中往往与人新鲜血清反应性不同而产生基质偏差。如总胆固醇测定基质效应研究指出：校准液酶法测定回收结果偏低可达5%~7%。

       7、试剂抗干扰作用的合理性

       有些液体双试剂，其实质并不真正具备抗干扰的能力而只是解决了试剂的液体化和稳定性问题。如，ALT试剂盒中，NADH在pH7.5~7.8水溶液中极不稳定，在pH>8.7时才能稳定保存。因此，为了保证试剂稳定性，液体双试剂的R1需要维持pH>8.7，但此时LDH活性大大下降，就失去消除内源性丙酮酸的功能，只有加入试剂R2后，反应混合液的pH下降至LDH最适pH，在经过延迟时间60 S后，才能消除内源性丙酮酸的干扰。再如，Tfinder反应中抗Vc干扰问题：由于维生素c易氧化，样品中Vc会竞争反应生成的过氧化氢，而产生负干扰。因此，在试剂R1中加入抗坏血酸氧化酶，这种方法是有效的，但不一定有很大的意义。因为Vc干扰必须同时具备二个条件：a)Vc摄入量较多；b)采血后立即测定。实验表明离体血清中Vc在90 min后会全部被氧化。又如，使用胺类新色原。a)分子共轭结构特性使得灵敏度提高，相应可以减少样本用量，最终能有效地降低干扰物的量．b)使生成胺类色素原最大吸收峰由500~520 nm移至550 nm以上，以避开黄疸、溶血干扰。如：亚铁***一H 0 ，能有效避免黄疸干扰的理论依据是亚铁***与H。0。亲和力远远大于胆红素。

       甘油三酯测定，有人主张选用双试剂方法消除内源性甘油，这个方法是可行的，但忽视了一个化学平衡理论。因为所有的酯在水溶液中都不是简单地以酯的形式存在，而是以水解与酯化相平衡的形式存在。在一个平衡体系中，如果去除游离甘油，这个平衡就向生成甘油方向移动，甘油三酯就会重新水解，生成新的甘油，达到新的平衡，因此样品与R1试剂孵育时间越长，测得甘油三酯值就越低。甘油三酯测定，不仅要去除游离甘油，而且还要克服样本含量真实性发生的变化，试剂中必须加入甘油激酶，并且延迟时间要标准化。所以，一些试验项目在消除内源性物质干扰的同时，会带来样品含量真实性的变化。

       参考文献

       [1] 韩志钧，黄志锋，卢业成，主编．临床化学常用项目自动分析法[M]．沈阳：辽宁科学技术出版社，2005．29—112．
       [2] 张万忠．临床生化试剂盒质量评估方法[J]．上海医学检验杂志，1991，6(4)：213．
       [3] 陆永绥，张伟民，主编．临床检验管理与技术规程[M]．杭州：浙江大学出版社，2004．588—592．
       [4] 冯仁丰，编．临床检验质量管理技术基础[M]．上海：上海科学技术文献出版社，2003．96-97．




                                                                                                                                                               文章来源：检验世界mtn

[ 本帖最后由 xingguoyan 于 2009-7-31 21:19 编辑 ]

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酶联免疫吸附试验基本原理与方法类型

　　1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）用于IgG定量测定的文章，使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。这一方法的基本原理是：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。

方法类型和操作步骤

　　ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体，②酶标记的抗原或抗体，③酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。 　
　  （一）双抗体夹心法
　　双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：
　　（1）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。
　　（2）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。
　　（3）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。
　　（4）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。
　　根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。
　　（二）双位点一步法
　　在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步（图15-5）。这种双位点一步不但简化了操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显著提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的ELISA提高到新水平。
　　在一步法测定中，应注意钩状效应（hookeffect），类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果。
　　（三）间接法测抗体
　　间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下：
　　（1）将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原：洗涤除去未结合的抗原及杂质。
　　（2）加稀释的受检血清：其中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体。其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。
　　（3）加酶标抗抗体：与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。例如欲测人对某种疾病的抗体，可用酶标羊抗人IgG抗体。
　　（4）加底物显色：颜色深度代表标本中受检抗体的量。
　　本法只要更换不同的固相抗原，可以用一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体。
（四）竞争法
　　竞争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比。操作步骤如下：
　　（1）将特异抗体与固相载体连接，形成固相抗体。洗涤。
　　（2）待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，使之与固相抗体反应。如受检标本中无抗原，则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。如受检标本中含有抗原，则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合，竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。参考管中只加酶标抗原，保温后，酶标抗原与固相抗体的结合可达最充分的量。洗涤。
　　（3）加底物显色：参考管中由于结合的酶标抗原最多，故颜色最深。参考管颜色深度与待测管颜色深度之差，代表受检标本抗原的量。待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。
　　（五）捕获法测IgM抗体
　　血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定。因此测定IgM抗本多用捕获法，先将所有血清IgM（包括异性IgM和非特异性IgM）固定在固相上，在去除IgG后再测定特异性IgM。操作步骤如下：
　　（1）将抗人IgM抗体连接在固相载体上，形成固相抗人IgM。洗涤。
　　（2）加入稀释的血清标本：保温反应后血清中的IgM抗体被固相抗体捕获。洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分。
　　（3）加入特异性抗原试剂：它只与固相上的特异性IgM结合。洗涤。
　　（4）加入针对特异性的酶标抗体：使之与结合在固相上的抗原反应结合。洗涤。
　　（5）加底物显色：如有颜色显示，则表示血清标本中的特异性IgM抗体存在，是为阳性反应。
　　（六）应用亲和素和生物素的ELISA

        亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每个分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密结合。现在使用更多的是从链霉菌中提取的链霉和素（strepavidin）。生物素（biotin）又称维生素H，分子量244.31，存在于蛋黄中。用化学方法制成的衍生物，生物素－羟基琥珀亚胺酯（biotin-hydroxysuccinimide，BNHS）可与蛋白质、糖类和酶等多种类型的大小分子形成生物素化的产物。亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定。由于1个亲和素分子有4个生物素分子的结合位置，可以连接更多的生物素化的分子，形成一种类似晶格的复合体。因此把亲和素和生物素与ELIS偶联起来，就可大提高ELISA的敏感度。




                                                                                                                                                              文章来源：检验世界

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消除胆红素对肌酐测定的负干扰
        摘要：胆红素对碱性***速率法检测肌酐的负干扰。一直是临床化学技术中学的一个棘手的问题，对临床高胆红素血症病人的肾功能观察带来很大影响。多年来，国内外不少作者报道了排除这一干扰的方法，但多是从样品预处理或试剂中加入抗干扰成分（如高铁***、胆红素氧化酶、过氧化氢——过氧化物酶）入手，最近国内外有人报道利用酶法和某些全自动生化分析仪的特殊功能Rate-Blank或Rate-B法能够从方法学角度排除干扰，并取得了良好的效果。本文就这一问题进行回顾和评价，并对各方法进行比较。

　　关键词：肌酐；Jaffe法；速率法；胆红素

　　测定血清肌酐（简称CRT）的Jaffe氏法已经沿用了100多年，至今仍然被广泛地应用，然而对肌酐的显色并不特异。血清中能与碱性***反应的物质还有蛋白质、葡萄糖、抗坏血酸、丙酮、α-酮酸等。这些“假肌酐”物质通常对肌酐测定产生正干扰。由于它们的反应速度比肌酐慢，因此利用速率法在20～100s间进行测定[1]可以使肌酐的反应占绝对优势，提高反应的特异性。尽管如此，仍旧不能克服胆红素对测定的负干扰。如何消除这一干扰，近年来，已经有许多报告。本文就这一问题进行回顾和评价。

　　1 胆红素对肌酐测定产生负干扰的原理

　　碱性***速率法测定的原理是肌酐同碱性***反应形成了一种红色复合物，通常在510nm外根据测定时间（20～80s）内血清和标准液吸光度的增加量计算肌酐的含量。而胆红素在510nm处也有较强光吸收，并且在氢氧化钠的作用下，逐渐转化为620nm处有强光吸收的胆绿素，而胆绿素在520nm处只有很弱的光吸收，这样就掩盖了肌酐本身的显色反应的表现，从而使测定结果偏低，甚至出现负值。有实验证明[1]，氢氧化钠对胆红素的作用与肌酐存在与否无关；肌酐含量越低，本身的显色反应弱，相对干扰就严重。血清中的游离、结合胆红素对肌酐的动力学测定都有干扰作用。

　　2 预处理法

　　预处理法主要是利用各种氧化物，使胆红素被氧化成胆绿素后再测定血清肌酐含量。加入的氧化物主要有以下几种：

　　2.1 高铁*** OLeary和pembroke等人[2]设置试剂1（R1）：高铁***2mmol/L，试剂2（R2）：氢氧化钠200mmol/L，若味酸25mmol/L，临用前按5：1配制。标本：R1：R2=20μL：20μL：400μL。主波长505nm，副波长570nm。样品与R1混合后5min再加入R2，延滞时间60s，读数时间60s。试验证明600μmol/L以内的胆红素对肌酐测定无影响。汪俊军等人[3]推荐含有十二烷基硫酸钠、硼酸、氢氧化钠、***、高铁***浓度分别为24、10、200、15.5、0.20mmol/L的试剂配方为临床实验室自动化分析测定肌酐的试剂配方，样本与试剂体积比为3：29，其它参数：波长520nm，温度37℃，测定时间30s，延迟时间20s。汪氏认为当高铁***浓度达到0.20mmol/L时，转变1000μmol/L的胆红素可以在前20s内基本完成。可以看出用高铁***可以较好地消除胆红素对肌酐测定的干扰，但范仲元等人[4]提出加入的高铁***的量对测定结果有一定影响。试剂中加入高铁***后，标准液的反应速率有下降趋势。血清标本反应速率在加入高铁***浓度较低时有下降，但下降比率远较标准液为小，而加入浓度较高时反应速率有明显升高，总的效果是加入高铁***后使肌酐测定结果升高，且随高铁***浓度的升高而升高。

　　2.2 过氧化氢——过氧化物酶 叶耀征等人[5]取黄疸病人血清200μL，加入1.76mol/L过氧化氢5μL混合，再加800KU/L过氧化物酶5μl，充分混合后置37℃水浴15min。3000rpm离心3min后再与碱性***试剂反应测定血清肌酐。试验证明200μmol/L以内的胆红素对肌酐测定无影响。可以看出，由于在消除胆红素过程中需要一定的水浴时间和温度，此法比较繁琐，不利于全自动生化分析仪操作。为了克服以上缺点，Rajs等人[6]将该法进行改良，认为由于间接胆红素与白蛋白为非共价结合，所以过氧化氢对直接胆红素的氧化过程快于对间接胆红素的氧化，为了提高氧化效率，缩短氧化时间，将**——苯甲酸盐加入过氧化氢——过氧化物酶中，使间接胆红素从蛋白质中置换出来，37℃反应7min（多数情况下，3～5min已经足够）后，再加入碱性***试剂测定血清肌酐。用该法在Cobas mira全自动生化分析仪上证明435μmol/L以内的胆红素对测定无影响。尽管如此，由于过氧化氢与过氧化物酶、氢氧化钠与***需临用前配制且不宜久置，所以操作上仍比较繁琐。
2.3 胆红素氧化酶 Lorene等人[7]利用胆红素氧化酶在肌酐测定前预处理血清样品取得了良好效果。其中胆红素氧化酶1000U/L。室温孵育15min。国内陈伟英等人[8]利用胆红素氧化酶在Cobas fARA-Ⅱ型全自动生化分析仪上也取得了类似的效果，将样品8μL与胆红素氧化酶（200U/ml）8μL混合，以胆红素氧化酶氧化样品中的胆红素，再加入若味酸试剂80μL作为起动试剂，进行肌酐测定，其中保温时间90s，反应时间100s。但由于胆红素氧化酶不易获得且成本较昂贵，因此该法在国内未得到普及。

　　3 采用酶法测定肌酐

　　piero fossati等[9]和张厚亮等[10]利用该法测定血清肌酐，其中试剂1：N-哌嗪-N′-2-乙烷磺酸（HEPES）-NaOH缓冲液、肌酸脒基水解酶（CRTase）、尿素酶、谷氨酸脱氢酶（GLD）、异柠檬酸脱氢酶（ICD）、α-酮戊二酸。试剂2：HEPES-NaOH缓冲液、CRNase、反式N，N，N’，N’-四乙酸-1，2-二氨基环乙烷（CYDTA）。其反应原理略。

　　酶法测定肌酐具有操作简便、特异性好、灵敏度高、不受胆红素及多种药物影响、适用于全自动或半自动生化分析仪，不仅能测定血清，而且也可以测定尿液，是目前认为测定肌酐最好的方法，但是其价格相当昂贵，一般至少是碱性***法的10倍以上，就国内医疗水平，难以普及。

　　4 采用Rate-Blank或Rate-B法测定肌酐

　　rate-Blank法是利用全自动或半自动生化分析仪中的特殊功能（样品速率空白）来达到克服胆红素干扰的目的。所谓样品速率空白是指将样品与试剂1（氢氧化钠）混合后作为样品空白测得的反应速率，也就是一样品中胆红素被氢氧化钠氧化吸光度下降的反应速率，仪器经过自动扣除这种反应速率，将胆红素的负干扰值自动补偿入肌酐与碱性***的反应中，从而达到了消除干扰的目的。Hoffman rJ、Gerhard g及Alecey v Moshkin等人[11~13]利用Rate-Blank法在Hitachi737、736、Cobas mIRA上取得了良好效果。N.O’Leary等人[1]将高铁***法与Rate-Blank法相比较发现两法有很好的一致性。

　　rate-B法（twin test）是利用同一反应杯在一个反应周期内进行两个试验测定的功能。如果这两个试验均为速率法时，第一个反应的速率可以自动补偿入第二个反应的速率中去。我们把血清肌酐测定过程分解为两个试验，第一个试验测定胆红素在碱性环境下被氧化引起吸光度减少的速率，第二个试验测定加***后，肌酐与***反应所引起吸光度增高以及胆红素被氧化所引起的吸光度减少的总的速率。即前者测定胆红素的干扰，通过仪器微机自动处理，后者在结果计算中自动清除这种干扰，从而利用RATE-B法达到清除胆红素对肌酐测定干扰的目的。Osselaer、Lievens及石凌波、林龙顺等人[14，15]利用该法在Hitachi717、704、747、7150分析仪上取得良好效果。

　　rate-Blank或Rate-B法从方法学角度克服了黄疸对肌酐测定的干扰，试剂中不加任何附属成分，操作简便，与酶法结果一致，但此法在应用过程中受到了仪器的局限性。

　　5 小结

　　近年来，国内外关于胆红素对肌酐测定的负干扰已有许多报道，总的来说，以上的方法各有千秋。预处理法由于添加了其它成分，操作不可避免地显得冗长、繁琐，另一方面因为附加成分的介入，破坏了原有反应体系，可能又会引起新的干扰。但是对于缺乏Tate-Blank或Rate-B法的生化分析仪，预处理法不失是一种很好的消除干扰的方法。而酶法测定肌酐由于价格的关系，目前只被国内少数医院接受，难以普及。我们认为各单位可以根据自己的实际情况来选择测定肌酐的方法。




                                                                                                                                                                文章来源：检验世界

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酶标仪的维修实例及使用探讨
贾岩，蔡永前 (新疆[根据相关法规进行屏蔽]尔自治区人民医院器械维修中心，新疆**830001)

    酶标仪在实际应用中很广泛，如应用在临床鉴别乙肝两对半，HIV等很多方面。在临床实验方面应用在鉴定DNA等许多方面，可以说它是临床及医学实验不可或缺的基础设备。

故障一：测量的结果重现性不好，即使用空板测量误差也在允许的范围之外。

故障分析：检查试剂发现没有问题，检查判定公式也没有问题，检查光路也没有污染。几经周折终于发现卡微板的卡簧在伸缩后没有卡到位，造成微板在测量时在机内晃动影响测量结果不准。

故障二：测量结果OD值偏低。

故障分析：排除完灯的能量值偏低后，检查发现滤光片上有灰尘，用蒸馏水和擦镜纸擦洗赶紧晾干后故障排除。

测试方法：酶标仪的仪器指标在最佳状态，就仪器的精度测试和仪器的线性度介绍几种测试方法：

精度测试：该过程可被用于检测不同微板之间的测量精度。使用新制备的在0．1％ TWEEN20中的橘黄色甲基填充微孔，在每个微孔中使用不同稀释度的溶剂以便获得一个光密度范围，首先确保每孔注入200mL液体，使用492nm虑光片测量至少3次，对每一微孔进行下列计算：(1)平均OD值；(2)最高和最低值；(3)平均值。最高和最低值之间的差值和百分比。读数范围在0．000到2．000Abs。同一孔平均值，最高值和最低值之间的差值应该在+／一1．0％和+／一0．010OD范围内。

读数范围在2．000到3．000Abs同一孔平均值，最高和最低值之间的差值应在+／一1．0％ 和+／一0．005OD值范围内。读数范围在3．000Abs以上时准确度不符合要求。

    仪器线性度：仪器的线性度可使用一种溶剂的稀释系列得到。如可在492 nIn处测量在0．1％TWEEN20中的橘黄色甲基的稀释系列，具体方法如下：在参考光密度计上测量被稀释的溶剂，画出OD值对已知浓度的点图，并画出通过这些点的最好的直线。将从系列稀释中测得的吸光度值与该图比较从而计算出各稀释度的浓度。微板中每种稀释度加入250t,-L，对每种稀释至少使用两个样本，以便降低因加样引起的误差。

    测量微板使用精确测量模式，利用测量得到的平均OD值和每个样本的已知浓度画一条OD浓度的曲线，从系列稀释中测得的吸光值与该曲线比较从而计算出各稀释度的浓度。对光度记和本仪器，比较计算的浓度，不准确度不应大于以下，使用标准滤光片492nm时吸光度在0．000～2．000Abs+／一1％、2．000～3．000Abs+／一1．5％。使用梯度滤光片492nm时，吸光度在0．000～2．500Abs+／一2％。


来源：检验世界网

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