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ELISA知识讲座之四
ELISA的试剂(下)
3.2 结合物
结合物即酶标记的抗体(或抗原),是ELISA中最关键的试剂。良好的结合物应该是
既保有酶的催化活性,也保持了抗体(或抗原)的免疫活性。结合物中酶与抗体(或抗
原)之间有恰当的分子比例,在结合试剂中应尽量不含有或少含有游离的(未结合的)酶
或游离的抗体(或抗原)。此外,结合物尚要有良好的稳定性。
3.2.1 酶
用于ELISA的酶应符合以下要求:纯度高,催化反应的转化率高,专一性强,性质稳
定,来源丰富,价格不贵,制备成酶结合物后仍继续保留它的活性部分和催化能力。最好
在受检标本中不存在相同的酶。另外,它的相应底物易于制备和保存,价格低廉,有色产
物易于测定等。
在ELISA中,常用的酶为辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)和碱性磷
酸酶(alkaline phosohatase, AP)。在少数商品ELISA试剂中,应用的酶尚有葡萄糖氧化
酶、β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。
国产ELISA试剂一般都用HRP制备结合物。HRP是一种糖蛋白,含糖量约为18%,分
子量为44000,是一种复合酶,由主酶(酶蛋白)和辅基(亚铁血红素)结合而成,是一
种卟啉蛋白质。主酶无色糖蛋白在275nm波长处有最高吸收峰,辅基是深棕色的含铁卟啉
环,在403nm波长处有最高吸收峰。HRP的纯度用RZ(Reinheit Zahl,德文,意为纯度
数)表示,是403nm的吸光度与280nm吸光度之比,高纯度的HRP的RZ≥?.0。
HRP除符合上述的ELISA中标记酶的要求外,更有价格低廉和性质较稳定的特点。值
得注意的是,在选用酶制剂时,除其纯度RZ外,更应注意酶的活力。高纯度的酶如保存不
当,活力也会降低。酶制剂的活力以所含的酶活力单位表示,可用对底物作用后生成产物
量的测定进行试验。
国外很多ELISA试剂采用碱性磷酸酶(AP)作为标记酶。常用的AP有两个来源,分别
从大肠杆菌和小牛肠膜中提取。不同来源的酶生化特性特性略不相同,从大肠杆菌中提取
的AP分子量为80000,酶作用的最适合pH为8.0;用小牛肠膜中提取的AP分子量为
100000,最适pH为9.6。在ELISA中,AP系统的敏感度一般高于HRP系统,空白值也较
低,但AP价格昂贵,制备结合物所得率也较HRP低。
3.2.2 抗原和抗体
制备结合物时所用抗体一般 均为纯度较高的IgG,以免在与酶联结时其他杂蛋白的干
扰。最好用亲和层析纯的抗体,这样全部酶结合物均具有特异的免疫活性,可以在高稀
释度进行反应,实验结果本底浅淡。如用F(ab')2进行标记,则更可避免标本中RF的干扰。
在ELISA中用酶标抗原的模式不多,总的要求是抗原必须是高纯度的。
3.2.3 结合物的制备
酶标记抗体的制备方法主要有两种,即戊二醛交联法和过碘酸盐氧化法。
(1)戊二醛交联法:戊二醛是一种双功能团试剂,它可以使酶与蛋白质的氨基通过
它而联结。碱性磷酸一般用此法进行标记。交联方法一步法、两步法两种。在一步法中戊
二醛直接加入酶与抗体的混合物中,反应后即得酶标记抗体。
ELISA中常用的酶一般都用此法交联。它具有操作简便、有效(结合率达60%-70%)
和重复性好等优点。缺点是交联反应是随机的,酶与抗体交联时分子间的比例不严格,结
合物的大小也不均一,酶与酶,抗体与抗体之间也有可能交联,影响效果。在两步法中,
先将酶与戊二醛作用,透析除去多余的戊二醛后,再与抗体作用而形成酶标抗体。也可先
将抗体与戊二醛作用,再与酶联结。两步法的产物中绝大部分的酶与蛋白质是以1:1的比
例结合的,较一步法的酶结合物更有助于本底的改善以提高敏感度,但其偶联的有效率较
一步法低。
(2)过碘酸盐氧化法:本法只适用于含糖量较高的酶。辣根过氧化物酶的标记常用
此法。反应时,过碘酸钠将HRP分子表面的多糖氧化为醛基很活泼,可与蛋白质上的氨基
形成Schiff氏碱而结合。酶标记物按克分子比例联结,其最佳比例为:酶/抗体=1-2/1。此
法简便有效,一般认为是HRP最可取的标记方法,但也有人认为所有试剂较为强烈,各批
实验结果不易重演。
按以上方法制备的酶结合物一般都混有未结合物的酶和抗体。理论上,结合物中混有
的游离酶一般不影响ELISA中最后的酶活性测定,因经过彻底洗涤,游离酶可被除去,并
不影响最终的显色。但游离的抗体则不同,它会与酶标抗体竞争相应的固相抗原,从而减
少了结合到固相上的酶标抗体的量。因此制备的酶结合物应予纯化,去除游离的酶和抗体
后用于检测,效果更好。纯化的方法很多,分离大分子化合物的方法均可应用。硫酸铵盐
析法最为简便,但效果并不理想,因为此法只能去除留在上清中的游离酶,但相当数量的
游离抗体仍与酶结合物一起沉淀而不能分开。用离子交换层析或分子筛分离更为可取,高
效液相层析法可将制备的结合物清晰地分成三个部分:游离酶、游离抗体和纯结合物而取
得最佳的分离效果,但费用较贵。
结合物制得后,在用作ELISA试剂前尚需确定其适当的工作浓度。使用过浓的结合
物,既不经济,又可使本底增高;结合物的浓度过低,则又影响检测的敏感性。所以必须
对结合物的浓度予以选择。最适的工作浓度就是指结合物稀释至这一浓度时,能维护一个
低的本底,并获得测定的最佳灵敏度,达到最合适的测定条件和测定费用的节省。就酶标
抗体本身而言,它的有效工作浓度是指与其相应抗原包被的载体作试验时,能得到阳性反
应的最高稀释度。例如某一HRP:抗人IgG制剂标明的工作浓度为1:5000,表示该制剂经
1:5000稀释后,在与人IgG包被的固相作ELISA试验时,将发生阳性反应。但在用于具体
的ELISA检测中,酶标抗体的最适工作浓度受到固相载体的性质、包被抗原或抗体的纯度
以及整个检测系统如标本、反应温度和时间等的影响,因此必须在实际测定条件下进
行"滴配"选择能达到高敏感度的最大稀释度作为试剂盒中的工作浓度。
3.2.4 结合物的保存
酶标抗体中的酶和抗体均为生物活性物质,保存不当,极易失活。高浓度的结合物较
为稳定,冰冻干燥后可在普通冰箱中保存一年左右,但冻干过程中引起活力的减低,而且
使用时需经复溶,颇为不便。结合物溶液中加入等体积的甘油可在低温冰箱或普通冰箱的
冰格中较长时间保存。早期的ELISA试剂盒中的结合物一般均按以上两种形式{MOD},配以
稀释液(见3.2.5)临用时按标明的稀释度稀释成工作液。现在较先进的ELISA试剂盒均已
用合适的缓冲液配成工作液,使用时不需再行稀释,在4-8℃保存期可达6个月。由于蛋白
质浓度较低,结合物易失活,需加入蛋白保护剂。另外再加入抗生素(例如庆大霉素)和
防腐剂(HRP结合物加硫柳泵,AP结合物可加叠氮钠),以防止细菌生长。
3.2.5 结合物的稀释液
用于稀释高浓度的结合物以配成工作液。为避免结合物在反应中直接吸附在固相载体
上,在稀释缓冲液中常加入高浓度的无关蛋白质(例如1%牛血清白蛋白),通过竞争以
抑制结合物的吸附。一般还加入具有抑制蛋白质吸附于塑料表面的非离子型表面活性剂,
如吐温20,0.05%的浓度较为适宜。在间接测定抗体时,血清标本需稀释后进行测定,也
可应用这种稀释液。
3.3 酶的底物
3.3.1 HRP的底物
HRP催化过氧化物的氧化反应,最具代表性的过氧化物为H2O2,其反应式如下:
DH2+ H2O2 D+ H2O
上式中,DH2为供氧体,H2O2为受氢体。在ELISA中,DH2一般为无色化合物,经酶
作用后成为有色的产物,以便作比色测定。常用的供氢体有邻苯二胺(O-
phenylenediamine,OPD)、四甲基联苯胺(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine,TMB)和ABTS
[2,2'-azino-di-(3-ethylbenziazobine sulfonate-6)]。
OPD氧化后的产物呈橙红色,用酸终止酶反应后,在492nm处有最高吸收峰,灵敏度
高,比色方便,是HRP结合物最常用的底物。OPD本身难溶于水,OPD·2HCL为水溶
性。曾有报道OPD有致异变性,操作时应予注意。OPD见光易变质,与过氧化氢混合成底
物应用液后更不稳定,须现配置现用。在试剂盒中,OPD和H2O2一般分成二组分,OPD
可制成一定量的粉剂或片剂形式,片剂中含有发泡助溶剂,使用更为方便。过氧化氢则配
入底物缓冲液中,有制成易保存的浓缩液,使用时用蒸馏水稀释。先进的ELISA试剂盒中
则直接配成含保护剂的工作浓度为0.02% H2O2的应用液,只需加入OPD后即可作为底物应
用液。
TMB经HRP作用后共产物显蓝色,目视对比鲜明。TMB性质较稳定,可配成溶液试
剂,只需与H2O2溶液混和即成应用液,可直接作底物使用。另外,TMB又有无致癌性等
优点,因此在ELISA中应用日趋广泛。酶反应用HCL或H2SO4终止后,TMB产物由蓝色呈
黄色,可在比色计中定量,最适吸收波长为405nm。
ABTS虽不如OPD和TMB敏感,但空白值极低,也为一些试剂盒所采用。
另一种HRP的底物为3-(4-羟基)苯丙酸[3-(4-hydroxy)phenly propionic acid,HPPA],
经HRP作用后,产物显荧光,可用荧光光度计测量。用于ELISA的优点为可加宽定
量测定的线性范围。
HRP对氢受体的专一性很高,仅作用于H2O2、小分醇的过氧化物和尿素过氧化物
(urea peroxide)。H2O2应用最多,但尿素过氧化物为固体,作为试剂较H2O2方便、稳
定。试剂盒{MOD}尿素过氧化物片剂,用蒸馏水溶解后,在底物缓冲液中密闭、低温(2
~8℃)可稳定1年。
3.3.2 AP的底物
AP为磷酸酯酶,一般采用对硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate,p-NPP)作为底
物,可制成片剂,使用方便。产物为黄色的对硝基酚,在405nm波长处有吸收峰。用
NaOH终止酶反应后,黄色可稳定一时间。
AP也有发荧光底物(磷酸4-甲基伞酮),可用于ELISA作荧光测定,敏感度较高于用
显色底物的比色法。
3.4 洗涤液
在板式ELISA中,常用的稀释液为含0.05%吐温20磷酸缓冲盐水。
3.5 酶反应终止液
常用的HRP反应终止液为硫酸,其浓度按加量及比色液的最终体积而异,在板式
ELISA中一般采用2mol/L。
3.6 阳性对照品和阴性对照品
阳性对照品(positive control)和阴性对照品(negative control)是检验试验有效性的控
制品,同时也作为判断结果的对照,因此对照品,特别是阳性对照品的基本组成应尽量与
检测标本的组成相一致。以人血清为标本的测定,对照品最好也为人血清,因为正常人血
清在各种ELISA模式中可产生不同程度的本底。由于大量正常人血甭较难得到,国外试剂
盒中的对照品多以复钙人血浆(recalcified human plasma)为原料,即在血浆中加入钙离
子,使其中的纤维蛋白质凝固,除去凝块后所得的液体,其组成与血清相似。阴性对照品
须先行检测,确定其中不含待测物质。例如HBsAg检测的阴性对照品中不可含HBsAg,最
好抗HBs也是阴性。阳性对照品多以含蛋白保护剂的缓冲液为基质,其中加入一定量的待
检物质,此量最好在试剂说明书中标明。加入的量应与试剂的敏感度相称,在测定中得到
的吸光值与受检标本吸光值比较,可对标本中受检物质的量有一个粗略的估计。国外检测
HBsAg的ELISA试剂盒检测敏感度约为0.5ng/ml,阳性对照品中含量约为10ng/ml。在对照
品中一般加入抗生素和防腐剂,以利保存。
3.7 参考标准品
定量测定的ELISA试剂盒(例如甲胎蛋白质癌胚抗原测定等)应含有制作标准曲线用
的参考标准品,应包括覆盖可检测范围的4-5个浓度,一般均配入含蛋白保护剂及防腐剂
的缓冲液中。 |
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