白果内酯与神经保护

谢*

　　　　白果内酯通过保护0XPHOS的复合物I和III允许线粒体在局部缺血的条件下维持细胞呼吸活动。

　　白果内脂具有以下神经保护作用
　　A　防止脑水肿 　　　B　预处理可减少脑缺血范围

　　银杏叶提取物广泛用于治疗脑血管和外周血管机能不全、与痴呆相关的症状，以及可能与老龄和衰老相关的认知衰退和感觉神经损伤。这些提取物经过充分标化后，约含有24％黄酮苷、6％萜烯三内酯(银杏苦内酯)，7％前花青素以及某些低分子有机酸。萜烯三内酯成份之一的 白果内酯约占标化银杏叶提取物的2．9％。本文简要回顾白果内酯具有神经保护特性的相关研究。

白果内酯对脑水肿和脑缺血的疗效
　　
　　早先的大鼠作用试验表明，服用标准银杏叶提取物，即“EGb 761”，可防止由三乙基锡引起的细胞毒性脑水肿，该作用与其白果内酯成分有关。从最近一些试验结果来看，人们认为，白果内酯这种抗水肿疗效的内在机理在于其防止氧化磷酸化(OXPHOS)的解偶联作用及其保护细胞膜抗击由缺氧引起的退化。局灶性脑缺血[大脑中动脉(MCA)闭塞]的小鼠试验表明，用白果内酯(≥5mg/kg s．c．)预处理，脑梗塞区以剂量依赖方式减少。该研究还发现，在大脑中动脉闭塞后立即施用白果内酯10 mg/kg (s．c．)，具有神经保护作用。以白果内酯(每天每公斤10mg)处理沙鼠，用药七天，可导致大脑皮质线粒体第3状态和第4状态的氧耗量，以及呼吸控制率(RCR)的增加。这一作用也可能与神经保护有关，因为第3状态呼吸率和呼吸控制率的增加意味着氧化磷酸化的保存和ATP合成。在另一项研究中，白果内酯抑制了来自大鼠海马切片的胆碱释放的增加，该海马切片事先浇注了无氧缓冲剂(IC50≌ 0.38μM)，表明白果内酯具有抗缺氧引起的胆碱磷酯水解的保护效果。抑制胆碱溢出的增加是白果内酯的特有作用，因为在银杏内酯混合物没有产生这种效果。白果内酯还抑制了N-甲基-d-门冬氨酸(NMDA)引起的(谷氨酸能)磷脂酶A2活化和磷脂衰竭，以及大鼠海马切片的胆碱溢出，后一效果是在采用2.3μM的IC50值时取得的。在给大鼠施用了白果内酯(2—20 6mg/kg，p．o．)后一小时准备海马切片，并在低氧条件下浇注，体外试验进一步说明，白果内酯保护切片免于缺氧引起的磷脂衰竭(体外，IC50≌6mg/kg)。以逆行性透析的方法将NMDA直接注射到自由活动大鼠的海马中也引起了胆碱释放，白果内酯(20mg/kg，i．p．)也同样抑制了该胆碱释放。

白果内酯保护线粒体功能
　　
　　Janssens等已经说明，白果内酯可抑制缺氧引起的血管内皮细胞中ATP含量的降低。这一效果可能与细胞性呼吸功能的增强有关，正如体外试验中发现的那样，大鼠口服白果内酯增加了从肝分离出来的线粒体的RCR。由此可推断，由于局部缺血可使0XPH0S解偶联，白果内酯能抵抗缺氧引起的ATP降低，只要存在一些氧气，就能保存线粒体，重新生成ATP。从采用白果内酯处理的大鼠身上分离出来的线粒体，可以进一步看到，这一类萜可保护线粒体免于安米妥引起的(OXPHOS的)复合物I的抑制，以及抗霉素A或粘噻唑引起的复合物III的抑制。因此，白果内酯可通过保护0XPHOS的复合物I和III允许线粒体在局部缺血的条件下维持其呼吸活动。

白果内酯与细胞存活

　　在浸泡介质中加入白果内酯(10μM)保护了从新生大鼠培养的海马神经元免受兴奋毒性损伤。以白果内酯(0.1μM)预处理从小鸡终脑培养的神经元可对低氧损伤提供极大保护。

　　最近，Ahlemeyer等发现，采用白果内酯(1μM)、EGb761(10μg/ml、银杏内酯B(10μM)和银杏内酯J(100μM)，可将因24小时处于缺失血清状态而引起的凋亡小鸡胚胎神经元上升现象降低到控制水平。白果内酯(10μM)还能将小鸡神经元星形孢菌素处理12小时所引起的凋亡损伤降低到接近控制水平。在取自新生大鼠海马的神经元和星形细胞的混合培养物中，总提取物(EGb761；100mg/l)和白果内酯(100μM)使神经元免于因血清缺失而引起的凋亡，白果内酯(100μM)和银杏内酯B(100μM)降低了星形孢菌素引起的凋亡损伤。研究人员认为，EGb 76l具有抗凋亡活性，白果内酯是最有效的成分。然而，与这些发现形成对比的是，还有一项研究表明，在浸泡成年大鼠海马神经元的主要培养物的介质中加入白果内酯(0.3-3.0μM)，并不能阻止细胞生存能力的降低，也无法防止因暴露于过氧化氢自由基生成物-2，2-偶氮双-2-脒基丙烷而引起凋亡细胞数的上升。细胞类型不同、引发凋亡的方法不同、两种研究中所使用的白果内酯浓度不同都可能是造成这种不一致的原因。

　　另外，还采用嗜铬细胞瘤衍生的PC12细胞做了研究。

　　Zhou等人发现，以β淀粉肽碎片25-35(Abetα(25-35)；100μM)处理PC12细胞达24小时，可显著降低细胞生存能力，而白果内酯(25-100μM)可以浓度依赖方式抑制这一细胞毒素效果。白果内酯还抑制了脂质过氧化作用的上升和Abetα(25-35)引起抗氧化酶活性的降低。在一项相关研究中，Zhou和Zhu表明，白果内酯(25-100μM)如与黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶(自由基生成系统)同时使用，可抑制PC12细胞中活性氧(ROS)引起的凋亡。通过分析DNA碎片，测定流式细胞计数，并评估半胱天冬酶-1和类似半胱天冬酶-3的蛋白酶活动，研究人员相信，白果内酯是通过阻断早期凋亡，然后削弱C-myc、P53和Bax以及半胱天冬酶-3活性的上升，来保护神经元免受氧化压力。

　　以白果内酯(10μM)对PC12细胞进行24小时预处理，也表明它对NO供体3-吗啉-代悉尼酮亚胺引起的损伤具有保护作用，因而能提高细胞生存能力。在这种情况下，过氧化酶和过氧化氢酶的活性增加了，这表明白果内酯的抗氧化和神经保护效果可能包含了抗氧化酶的诱导作用。

白果内酯和基因表达

　　迄今为止，只报道了少数涉及白果内酯和基因表达的研究。有关线粒体OXPHOS，Chandrasekaran等人以神经生长因子鉴别的大鼠PC12细胞的形态变体加以试验，研究结果表明，在培养介质中加入白果内酯 (15.3或30.6μM) 而不是银杏内酯B(11.8或23.6μM)，将细胞色素c氧化酶的线粒体DNA(mtDNA)编码的COX III亚单位提高了两倍。其它试验说明，在诱导完全脑缺血以前，给沙鼠口服七天银杏内酯(每天3或6mg/kg)，可保护海马CA1区神经元免于死亡以及缺氧引起的mtDNA编码的COX III mRNA降低。最近，Tendi等表明，将PC12细胞暴露于白果内酯(30.6μM)达48小时或72小时可增加(约两倍)NADH脱氢酶的DNA编码亚单位的mRNA(ND1) 水平。这些发现也支持白果内酯保护脑能量代谢和提供神经保护的观点。

　　有关NO合成酶(NOS)异构体和N0的产生，Cheung等人研究已经表明，白果内酯(0.8-3μM)抑制了诱导性酶(iNOS)在人体THP-1 巨噬细胞中催化产生NO，但不是通过内皮型一氧化氮合酶(eNOS)在人体内皮细胞(HUVEC)中产生NO。转移免疫印迹分析,结合核酸酶保护分析和反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)，表明在经过白果内酯处理的巨噬细胞中伴随着iNOS蛋白质量和mRNA的水平降低，但是，白果内酯不影响以eNOS为媒介的NO生成或者HUVEC中的eNOS蛋白质和mRNA的表达。这些结果表明，银杏提取物的白果内酯对iNOS表达具有选择性的抑制作用，不会影响以eNOS为媒介的NO生成。

　　白果内酯还能增加大鼠星形细胞中胶质细胞源性的神经营养因子(GDNF)和血管内皮生长因子(VEGF)的表达。采用PCR来判定GDNF和VCGF mRNAs，并采用免疫组织化学方法来探测GDNF和VEGF蛋白质表达，结果发现，以白果内酯(50μM)进行12小时处理，可显著提高GDNF和VEGF mRNAs，在以白果内酯(50μM)进行24小时处理后，在星形细胞的细胞质中能探测到GDNF和VEGF蛋白质。

合成白果内酯衍生物

　　迄今为止，有关合成白果内酯衍生物的研究已完成两项。Ahlemeyer等发现，4-羟基-4-叔丁基-2,3,5,6-四氢硫代-1-氧化吡喃(NV-31;1-100 nM)能保护从小鸡胚胎终脑培养的神经元免受因血清缺乏或以浓度依赖方式暴露于星形孢菌素而引起的凋亡损伤。在新生大鼠海马神经元和星形胶质细胞的混合培养物中，NV-31(100nM)还降低了星形孢菌素引起的神经元损伤。还有，在局灶性脑缺血之前一小时和缺血后即刻，给老鼠采用10和20 mg/kg－1处理，梗死区比赋形剂组的动物实验减少。这说明NV-31的抗氧化特性产生了神经保护效果。

　　在另一项研究中，Bouaziz等人发现，和白果内酯本身一样，两种合成白果内酯类似物丙二酸二环戊烯-2-酯(MRC2P119)和2-氧-3-氧杂-双环[3.1.0]己烷-1-羧酸烯丙基酯(MRC2P57)增加了被分离线粒体的RCR，阻碍了安米妥对线粒体复合物I的抑制以及粘噻唑对复合物III的抑制。此外，MRC2P119和MRCP2P57都以浓度依赖方式抑制了缺氧引起的内皮细胞的ATP含量降低，MRC2P119阻碍了因缺氧和缺氧/复氧引起的SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞生存能力的降低。研究结论是，这些新的分子具有抗缺血性，这可能应归功于OXPHOS复合物I和III的保护作用。

结论

　　最近几年中积累起来的证据表明，白果内酯具有神经保护作用。看来有必要进行进一步的研究以确定白果内酯治疗脑缺血和神经变性相关疾病的有效性。

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