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天坛医院 王雅杰 张琨
蛋白质组学的发展既是受技术推动的,也是受技术限制的。蛋白质组学研究成功与否,很大程度上取决于其技术方法水平的高低。蛋白质研究技术远比基因技术复杂和困难。不仅氨基酸残基种类远多于核苷酸残基,而且蛋白质有着复杂的翻译后修饰,如磷酸化和糖基化等,给分离和分析蛋白质带来很多困难。此外,通过表达载体进行蛋白质的体外扩增和纯化也并非易事,从而难以制备大量的蛋白质。
大规模蛋白质组分析过程包括样品制备(蛋白质的分离与显色成像)、图像分析(图像的采集和分析)、蛋白质成分的分析与鉴定(包括蛋白质的分子量和丰度,及通过特定算法推算出的蛋白质分子的结构等)。为此,双向电泳技术、计算机图象分析技术与大规模数据处理技术、质谱技术以及生物信息学技术被称为蛋白质组研究的基本支撑技术。样品的分离直接影响到下一步研究的结果,因此我们在本文中将详细介绍蛋白质组的分离技术。
一、样品制备
蛋白质样品的制备对于精确的蛋白质组分析尤为重要。制备样品的过程必须是可重复的,而且还应适合于随后的蛋白质分离和鉴定。目前常用的方法有:
1)制备的亚蛋白质组。根据特定蛋白质的特性(如疏水性、电性)来收集蛋白质,用于选择性溶解特定亚蛋白质组。
2)使用各种还原剂、手性试剂或去垢剂来破坏组织内和生物体液内的蛋白-蛋白和蛋白质-蛋白质之间的相互作用。
样品制备时必须注意的几个方面:简化样品处理过程,避免蛋白丢失;减少蛋白降解;避免样品的反复冻融;防止各种可能的非目标性蛋白修饰;保证清除所有杂质;样品裂解液应新鲜制备。
对较为特殊的样品(如膜蛋白多为低溶解性蛋白和偏碱性蛋白,[根据相关法规进行屏蔽]白虽具有中度溶解性,但多为强碱性蛋白),必要时采用特殊助溶剂或分步提取等制备方法。
二、样品分离
目前,双向凝胶电泳(2-DE)仍是最好的分离复杂蛋白质混合物的技术。一般来说可以从单个蛋白质样品中解析到2000~3000个蛋白质点,或可以从高通量常规凝胶中解析多达10000种蛋白质。虽然目前2-DE分析是最为广泛使用的蛋白质分离技术,但其他的一些蛋白质分离方法也可以达到2-DE的分离程度,有的还可以分离2-DE无法分离的亚蛋白质组。这些方法包括离子交换、分子筛法、高效液相色谱法(HPLC)、亲和层析色谱、毛细管IEF、毛细管电泳与质谱联用、柱层析、免疫沉淀、蛋白芯片以及蛋白质飞行质谱(SELDI)技术等技术。
(一)、双向电泳(2-DE):
2-DE是一种大规模的蛋白质分离技术,能将数千种蛋白质同时分离与展示。在2-DE中,蛋白质首先根据等电点的不同在一向等电聚焦电泳中分离,接着被转移到二向凝胶上,此时蛋白质是根据其相对分子质量大小不同而被分离。从20世纪70年代中期首次提出二维凝胶电泳,此项技术经历了几个不同的发展阶段:由最初的重复性差、上样量小到20世纪80年代初期出现的固相化pH梯度(IPG)等电聚焦电泳技术,使其重复性和上样量大大改善;与后续的微量鉴定技术和质谱技术的联合应用更使得2-DE获得了广泛的应用,成为蛋白质组研究中首选的分离技术之一。
1.一维等电聚焦电泳(IEF)
(1) 一维等电聚焦的基本原理:
把蛋白质加入到含有pH梯度的集体时,如果蛋白质所在的点的pH值与其等电点不符,则该蛋白质会带一定量的正电荷或负电荷。在高于其等电点的位置,蛋白质带负电,反之带正电。此时,如果加以强电场,蛋白分子会在电场作用下分别向正极或负极漂移。当达到其等电点位置时,蛋白质不带电,就不再漂移,这就是等电聚焦电泳的基本原理。
(2) 一维等电聚焦的基本过程:
首先是IEF凝胶的制备,此一步骤是电泳能否成功,结果是否精确的关键。早期的等电聚焦以合成载体两性电解质(sythetic carrier ampholyte,SCA)为介质,它的引入是等电聚焦技术的一大突破,但该技术仍存在其自身难以克服的缺陷:首先,SCA本身就是通过复杂的合成过程得到的,其重复性很难控制,这样从一开始就限制了2-DE分离的重复性;其次,SCA分子相对较小,难以在IEF胶内固定,导致pH值不稳定性增加。
固相pH梯度技术(IPG)的开发是真正的一维等电聚焦技术突破,其基本原理是:在快速形成的pH梯度中根据蛋白质移动能力进行蛋白质的分离,将适宜的IPG试剂添加至含有特定结构的丙烯酰胺衍生物系列(它们构成了分布在pH3-pH10范围不同值的缓冲体系)的混合物中用于凝胶的聚合,在聚合中,缓冲基团通过乙烯键共价聚合至聚丙烯酰胺骨架中,形成pH梯度。与传统的载体两性电解质预制胶相比,IPG胶具有机械性能好、重现性好、易处理、上样量大的特点,由于避免了电渗透作用,可以进行特别稳定的IEF分离,达到真正的平衡状态。
在高质量的凝胶基础上进行加样,有两种方案:一种是IPG胶重泡胀后,利用加样杯,边运行等电聚焦,边上样,利用加样杯上样的好处是在于加样量可以提高很多,由于加样杯直接和胶面接触,使得分子量大于100000Da的蛋白质可以有效地进入IPG胶条;另一种方案是将样品与重泡胀液混合,在IPG胶条泡胀的同时样品也渗入胶条,然后再加电压,即胶内泡胀法,其优点是泡胀和等电聚焦整合为一程序即可完成,高效和高可重复性,是目前常用的加样方法。重泡胀完成后可以加电压开始IEF。
为了提高2-DE的分辨率和蛋白质的检出率,对IPG胶条的改进研究一直都在进行,新的胶条不断出现。一方面,胶条的pH范围不断变窄;另一方面,发展出不同长度的胶条以满足不同的需要。此二种方法都是增加分辨率和检出率的有效方法。在IPG胶条已实现商品化的条件下,加样就成为决定这一周期2-DE成功与否的决定因素。因此,对于首次接触到制备样品或一维凝胶电泳的人来说,利用小胶(如7cm的IPG胶条)做一次预实验,可以节约时间,观察样品制备的好坏,积累经验,以避免不必要的损失。
其次是运行。重泡胀完成后,可以加电压开始IEF。由于胶条所能承受的电流有限,IEF过程中要避免电流过大,一般限流为50μA。最初样品中离子强度高电压应限制于200V、30min,逐步增压,最终电压至8000V并恒定运行若干小时。运行时间决定于几个不同因素,包括样品类型、蛋白上样量、IPG胶条长度及所用pH梯度。
2.二维SDS-聚丙烯酰胺
在一向IPG IEF后,胶条可马上用于二向,也可保存在两片塑料膜间,于-80℃存放几个月时间。在二向分离前,必须平衡IEF胶,平衡后方可上二胶。有两种方法平衡IEF胶:一种是分两步进行平衡;另一种为一步平衡。其中平衡液的主要作用是使一向胶上的蛋白质变性。平衡液中的SDS是一种阴离子去污剂,可以和蛋白定量结合,蛋白质与SDS重量之比为1:1.4,此时蛋白质所带负电荷过量,而且与蛋白质相对分子质量成正比关系。在电场作用下,各蛋白质依所带电荷数目迁移,迁移速率与电荷数成正比关系,也就实现了蛋白质相对分子质量方向上的分离。
3.染色(显色)
二维凝胶分离蛋白质的后续检测技术灵敏度的不断提高,使蛋白质显色的地位从简单的蛋白质点呈现转换为集成化的蛋白质微量化学表征过程中的关键步骤。由此,传统的考马斯亮蓝染色和银染在蛋白质组研究中的局限性日益暴露出来。新的染色技术如荧光标记、同位素标记技术在提高了灵敏度的同时,也与自动化的蛋白质组平台切胶技术和下游的蛋白鉴定质谱技术有很好的兼容性。染色技术正向高灵敏度和自动化方向发展。需要指出,不同染色方法对设备和仪器要求不同,需综合考虑实验中的各种因素,选择当前条件下的最佳方案。
(1) 考马斯亮蓝(Commassie blue)染色
考马斯亮蓝染料可以检测到30~100ng蛋白质,极限是8~10ng。考染的优点是染色过程简单,所需配制的试剂少,操作简单,无毒性,染色后的背景及对比度良好,与下游蛋白质鉴定方法兼容。在样品量允许情况下,考染是一个比较好的选择。考染的缺点是所需的时间长,染色过程大约需要24h~48h,灵敏度远低于银染和荧光染色检测。
(2) 银染
银染是非放射性染色方法中灵敏度最高的,其灵敏度可达200pg,成本较低,是目前差异蛋白质组分析中最常用的显色方法。缺点是,银染中醛类的特异反应,使得对凝胶酶切肽谱提取存在困难。目前大多数实验室采用银染凝胶进行图谱分析,后用加大上样量的方法进行考染,进而进行切胶的下游鉴定。但由于银染和考染特异性不同,使得这两种方法所得二维电泳图谱可比性不好,不利于蛋白质研究的高通量筛选。 |
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