【转贴】· 实验研究 · 胰腺癌患者红细胞CD35分子变化及其生物学意义的实验研究

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【摘要】

目的 研究胰腺癌患者红细胞、血小板、淋巴细胞和粒细胞膜上天然免疫分子 CD35 表达状况。
方法 采用流式细胞术，测定其细胞膜上 CD35 分子数量。
结果 28 例胰腺癌患者，红细胞、血小板、淋巴细胞和粒细胞 CD35 分子平均荧光强度分别为 51.36±21.61、41.66±24.67、95.95±40.12 和 634.20±295.64；30 例正常人平均荧光强度分别为 75.98±21.58、52.88±21.40、112.95±47.39 和 691.47±162.53，红细胞 CD35 分子与正常人比较 P < 0.01，有显著统计学意义。
结论 胰腺癌患者天然免疫分子 CD35 数量减少，天然免疫功能降低。  
**络杂志 2005;2

正文】

胰腺癌是一种临床表现隐匿，发展迅速而且预后极差的消化系统肿瘤，在西方国家胰腺癌是癌症死亡的主要原因之一[1]，美国胰腺癌在癌症死亡病例中居第4位，5年生存率仅为3%左右[2]，我国对胰腺癌的研究起步较晚，近几年来发病率明显上升，也已经成为我国消化系统肿瘤的主要死亡原因之一，尽管有关胰腺癌发病、转移机制方面已做了大量研究，但确切的机制仍未完全清楚[3]，对于胰腺癌患者红细胞、血小板、淋巴细胞和粒细胞膜上CD35分子分布表达情况，迄今为止还没有人研究报道过。本课题采用流式细胞术测定CD35分子在胰腺癌患者血细胞膜上的分布表达情况，与正常人群比较，找出差异，分析研究其生物学意义。

材料和方法

一、材料

1. 实验对象：本研究28例患者，均为长海医院外科住院病人，均经CT、ERCP、MRI、B超和（或）手术后病理诊断。其中男16例，女12例，年龄25 ~ 79岁，平均年龄56.3岁。正常对照30例，男18例，女12例，年龄23 ~ 54岁，平均年龄40.2岁，均为中国人民[根据相关法规进行屏蔽]上海血站健康献血者。

2. 主要仪器和实验试剂：美国BD公司FACSCALIBUR型流式细胞仪。瑞士Heraeus公司Megafuge 2.0R型可控温水平离心机。不同规格的进口和国产的移液器若干支。丹麦DAKO公司生产的鼠抗人CR1（CD35）单克隆抗体。中国华美生物工程公司生产的FITC荧光标记羊抗鼠Ig。上海生化试剂公司生产的Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液。PBS缓冲液、多聚甲醛固定液、生理盐水、蒸馏水和3.8%枸橼酸钠由中国人民[根据相关法规进行屏蔽]上海市血站长海医院输血科免疫室提供。

二、方法

1. 红细胞、血小板CD35分子流式细胞仪定量测定

红细胞、血小板悬液制备：静脉采集2 ml新鲜血，置入含有0.2 ml 3.8%枸橼酸钠抗凝的赶紧玻璃试管中，轻轻混匀后1 500 rpm离心3 min，上清为富含血小板的血浆（platelet-rich plasma，PRP）取出0.5 ml备用；下层为浓缩的红细胞，小心吸取下层浓缩的红细胞10 μl，用90 μl PBS缓冲液稀释混匀，即成为1×108/ml红细胞悬液，备用。

红细胞、血小板CD35分子流式细胞仪定量测定操作：在一编号赶紧的φ12 mm×70 mm塑料硅化试管中，分别加入PBS缓冲液50 μl，鼠抗人CR1（CD35）单克隆抗体1.5 μl，待测红细胞悬液0.8 μl，血小板悬液（PRP）30 μl，充分混匀，室温下避光静放30 min。再加入PBS缓冲液2 ml混匀洗涤，1 500 rpm离心5 min，弃上清液后加入FITC荧光标记羊抗鼠Ig（Ig-FITC）1 μl，充分混匀, 室温下避光静放30 min，再加入PBS缓冲液2 ml混匀洗涤，1 500 rpm离心5 min，弃上清液后加入PBS缓冲液300 μl，固定液1%多聚甲醛300 μl，混匀后上流式细胞仪检测红细胞、血小板CD35分子平均荧光强度，电脑设门分布计算。

2. 淋巴细胞、粒细胞CD35分子流式细胞仪定量测定

淋巴细胞、粒细胞悬液制备：用淋巴细胞分离液按常规分离，离心（水平离心2 000 rpm，15 min）吸取淋巴细胞层，用生理盐水洗涤1次，弃上清，配成1×107/ml淋巴细胞悬液备用。用淋巴细胞分离液，分离得到在红细胞层表面的粒细胞，加入蒸馏水2 ml上下吹打破坏红细胞（冰水中操作1 min），然后加入生理盐水使细胞恢复等渗，洗涤1次，水平离心2 000 rpm，5 min，弃上清，配成1× 107/ml粒细胞悬液备用。

淋巴细胞、粒细胞CD35分子流式细胞仪定量测定操作：在一编号赶紧的φ12 mm×70 mm塑料硅化试管中，分别加入PBS缓冲液50 μl，鼠抗人CR1（CD35）单克隆抗体1.5 μl，待测淋巴细胞悬液5 μl，粒细胞悬液5 μl，充分混匀，室温下避光静放30 min。再加入PBS缓冲液2 ml混匀洗涤，1 500 rpm离心5 min，弃上清液后加入FITC荧光标记羊抗鼠Ig（Ig- FITC）1 μl，充分混匀, 室温下避光静放30 min，再加入PBS缓冲液2 ml混匀洗涤，1 500 rpm离心5 min，弃上清液后加入PBS缓冲液300 μl，固定液1%多聚甲醛300 μl，混匀后上流式细胞仪检测淋巴细胞、粒细胞CD35分子平均荧光强度，电脑设门分布计算。

3. 统计学处理

数据用均数±标准差（）表示，结果用Student-t检验。

结 果

胰腺癌患者的CD35分子表达情况：胰腺癌患者红细胞CD35分子平均荧光强度显著低于正常人群，和正常人比较P < 0.01，差异有显著的统计学意义；血小板、淋巴细胞和粒细胞CD35分子平均荧光强度都分别低于正常人CD35分子平均荧光强度，和正常人比较均无统计学意义（表1）。

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注：和正常人相比，*P < 0.01


讨 论

自从1981年Siegel等提出“红细胞免疫系统”新概念以来，国内外学者的大量研究表明，红细胞膜上具有多种与免疫有关的物质，如CD35、CD44、CD58、CD59、IL-8受体、CD62P（P-选择素）和一些酶等，是机体免疫系统的一个重要组成部分。CD35分子的结构已经很清楚了[4]。本实验结果不仅证实了胰腺癌患者红细胞免疫受抑制，红细胞免疫功能紊乱与降低，而且，提示胰腺癌患者的免疫缺陷是多方面的，①红细胞膜的黏附大量IC，势必导致红细胞膜上C3b受**点被覆盖，引起CD35分子测量降低。②CD35分子的减少与体内蛋白酶的活性增强有关，提示CD35分子的减少可由肿瘤患者体内蛋白酶的活性增强促使CD35分子裂解而引起，是继发的。③肿瘤细胞在其生长过程中其表面可表达一定的特异性抗原，诱导机体产生特异性抗体，抗原抗体的结合导致体内循环免疫复合物的增多，当其与红细胞膜上CD35分子结合而不能迅速被清除时，亦可导致CD35分子受体的相对减少。此外，导致CD35分子数量减少也有遗传因素存在，Wilson报道SLE患者红细胞免疫功能低下可由遗传即CD35分子基因表达缺陷引起。本实验结果，发现胰腺癌患者的红细胞膜上CD35分子明显降低，与正常人比较，统计学处理P < 0.01，有显著性差异，具有统计学意义。血小板、淋巴细胞、粒细胞膜上CD35分子也都是降低的，但统计结果P > 0.05，只是有整体降低的趋势，得出胰腺癌患者天然免疫功能是降低的。由于红细胞可以增加粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞的吞噬能力，对机体免疫系统及其自身免疫机能产生调控作用，所以红细胞免疫功能的改变，也可以对机体整个免疫机能产生一定的影响，这和红细胞膜上CD35分子数量减少有关。有文献报道[5]，胰腺癌患者手术前后红细胞免疫功能的动态观察（采用RBC-C3bR、RBC-ICR的方法），提示根治手术对胰腺癌患者红细胞免疫功能的恢复是有益的，对胰腺癌患者红细胞免疫功能的测定，有助于判断肿瘤的转归疗效、对胰腺癌的治疗具有辅助诊断价值。现在采用先进的流式细胞术，直接测定细胞膜上CD35分子，操作简单方便，结果精确，更加有助于临床诊断和治疗的应用。


【参考文献】
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1 Ghaneh P, Kawesha A, Evans JD, et al. Molecular prognostic markers in pancreatic cancer. J Hepatobiliary Pancreat Surg, 2002, 9: 1-11.[PubMed]

2 Sohn TA. The molecular genetics of pancreatic ductal carcinoma. J Minerva Chir, 2002, 57: 561-574. [PubMed]

3 季晓昕, 李非, 孙家邦. 胰腺癌生长和转移机制的研究进展. 胰腺病学, 2003, 3(3): 172-175.

4 马兴铭, 于红娟, 何玉林, 等. 红细胞膜CD35分子研究进展. 中国医学理论与实践, 2003, 2003(11): 1479- 1480.

5 刘瑞, 胡志浩, 张怡杰, 等. 胰腺癌患者围手术期机体免疫功能的变化. 第二军医大学学报, 1999, 20(11): 889-891.